30 Jul
En el campo de la bioquímica, la identificación y caracterización de los carbohidratos son fundamentales. Diversas reacciones químicas permiten detectar la presencia de estos compuestos, así como diferenciar entre sus distintas clases, como monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. A continuación, se describen algunas de las pruebas más comunes y sus fundamentos.
Reacción de Molisch
La reacción de Molisch es una prueba general utilizada para determinar la presencia de carbohidratos en una muestra. Esta reacción reconoce cualquier carbohidrato presente en una disolución. Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante que ejerce el ácido sulfúrico concentrado sobre estos compuestos. Los ácidos concentrados originan una deshidratación de los azúcares para producir furfurales. Estos furfurales se condensan con los fenoles para dar productos coloreados característicos. La reacción de Molisch es la prueba más general que se utiliza para el reconocimiento de los carbohidratos libres o asociados a otras moléculas.
Fundamento Químico de Molisch
La acción del reactivo de Molisch sobre los oligosacáridos y los polisacáridos produce primero una hidrólisis de estos compuestos hasta sus monosacáridos correspondientes. Las pentosas originan furfural y las hexosas, hidroximetilfurfural. Los monosacáridos reaccionan directamente con el reactivo de Molisch. La presencia de carbohidratos se evidenciará mediante la formación de un anillo de color violeta en la interfase entre dos líquidos (ácido sulfúrico-solución glucosídica).
Prueba de Lugol
El reactivo de Lugol se utiliza específicamente para identificar polisacáridos. Los polisacáridos tratados con el Lugol originan diferentes compuestos coloreados que permiten reconocerlos. Se basa en la formación de un complejo entre el ion yoduro (I₃⁻) y la molécula de amilosa del almidón, la cual tiene una conformación helicoidal. Al introducirse el ion yoduro dentro de la hélice, se forma una solución de color azul, mientras que la amilopectina produce un color púrpura rojizo.
Al añadir una gota de solución de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico, I₂ y KI) al almidón, aparecerá un color azul-violeta intenso, y con el glucógeno, un color rojo caoba. Los monosacáridos y disacáridos no reaccionan con el yodo, y el color final corresponde a la coloración propia del reactivo de yodo (marrón claro o amarillo). La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es, por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul-violeta.
Prueba de Benedict
La prueba de Benedict es específica para determinar azúcares reductores con grupos carbonilo libres. Los carbohidratos, debido a la presencia en su estructura de grupos aldehídicos y cetónicos libres o potencialmente libres, en un medio alcalino y en caliente, forman un compuesto intermediario llamado enedioles, los cuales son capaces de reducir el hidróxido de cobre(II) a óxido cuproso (Cu₂O), que es un precipitado que varía de color desde el amarillo hasta el rojo ladrillo, de acuerdo con la concentración de glúcidos y al tiempo de calentamiento.
Aplicación y Fundamento del Reactivo de Benedict
El reactivo de Benedict se utiliza para evidenciar la presencia de grupos reductores en los carbohidratos. Son azúcares reductores todos los monosacáridos y disacáridos (excepto la sacarosa y la trehalosa). Los polisacáridos son, en su mayoría, azúcares no reductores; por lo tanto, podemos discriminar entre polisacáridos y disacáridos no reductores, pero no entre monosacáridos y disacáridos reductores. En la estructura de la sacarosa, observe que los carbonos anoméricos están ocupados en el enlace.
El reactivo de Benedict es particularmente útil en el laboratorio clínico para poner en evidencia la presencia de glucosa en la orina. El reactivo está formado por:
- Carbonato de sodio (Na₂CO₃)
- Sulfato de cobre(II) (CuSO₄)
- Citrato de sodio
Fundamento: El citrato de sodio evita que el hidróxido de cobre(II) formado precipite y pueda mantenerse en solución. Al calentar, el resto del hidróxido de sodio actúa convirtiendo los glúcidos con grupos aldehídos o cetónicos libres en enedioles que reducen los iones Cu²⁺ del hidróxido de cobre(II) en iones Cu⁺, los cuales se unen al oxígeno para formar óxido cuproso (Cu₂O) insoluble, el cual precipita generando una coloración rojo ladrillo.
Reacción de Barfoed
La reacción de Barfoed es una prueba que permite diferenciar monosacáridos de disacáridos. El fundamento radica en la reducción del acetato cúprico a óxido cuproso, el cual forma un precipitado de color rojo ladrillo. Los azúcares, debido a la presencia de grupos aldehídicos o cetónicos libres, son capaces, en presencia de ácidos diluidos y en caliente, de reducir el acetato de cobre(II) a óxido cuproso, que es un precipitado de color rojo.
Los monosacáridos reducen rápidamente al reactivo debido a que su grupo reductor se encuentra libre o potencialmente libre. Los disacáridos darán la reacción después de que hayan sido hidrolizados en los monosacáridos respectivos debido al medio ácido débil del reactivo; por lo tanto, el precipitado de color rojo en los disacáridos tarda más tiempo en aparecer.
Reacción de Bial
La reacción de Bial es específica para el reconocimiento de las pentosas. Se fundamenta en la reacción de deshidratación que sufren los carbohidratos en presencia de ácidos minerales y en caliente, produciendo furfural o derivados furfúricos. Estos compuestos se condensan con el orcinol (reactivo de Bial) originando productos coloreados. La prueba da positiva con la aparición de un color verde botella, brillante y totalmente transparente, indicando así la presencia de pentosas.
Reacción de Seliwanoff
La prueba de Seliwanoff es específica para las cetosas que contengan 5 o más átomos de carbono. Al ser tratadas con ácidos minerales en caliente, los carbohidratos se deshidratan formando furfurales, los cuales se condensan con la resorcina (Reactivo de Seliwanoff) originando compuestos de color rosado salmón. Por calentamiento prolongado, otros azúcares pueden dar una reacción positiva. Esta reacción permite identificar cetosas cuando la reacción es positiva en los primeros 30 segundos de ebullición.
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