ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA (FLUORIMETRÍA)

1. Fundamento de la Fluorescencia

La fluorescencia es un proceso de emisión atómica y/o molecular que ocurre cuando ciertas moléculas absorben luz de una longitud de onda específica ($\lambda_1$), y emiten luz a una longitud de onda mayor ($\lambda_2$), es decir, de menor energía. La intensidad y el color de la luz emitida son característicos de la sustancia fluorescente y no tienen, necesariamente, el mismo color que la luz absorbida.

El proceso de emisión se produce cuando los átomos o moléculas, previamente excitados, vuelven a su estado fundamental cediendo su exceso de energía en forma de radiación electromagnética (fluorescencia) de distinta longitud de onda a la energía de excitación, la cual podemos cuantificar.

• La luz emitida en la fluorescencia tiene menor energía que el haz de luz incidente.
• Por lo tanto, la luz emitida es de longitud de onda mayor que la correspondiente a la radiación absorbida o de excitación.

La fluorimetría es una técnica de laboratorio que permite determinar el tipo y la intensidad de una radiación fluorescente emitida por una sustancia que previamente ha sido sometida a la acción de una radiación. El cálculo de la luz fluorescente emitida permite realizar el análisis cualitativo y cuantitativo del compuesto que la emite. Es una técnica sencilla (como otras técnicas fotométricas) y con una alta sensibilidad y especificidad.

Fenómenos Relacionados

• Fosforescencia: Se produce tras la irradiación de la materia y se mantiene durante un tiempo que oscila desde unos pocos segundos hasta minutos u horas. Es similar a la fluorescencia (emite energía electromagnética), pero es más lenta; absorbe energía y la va acumulando para emitirla poco a poco.
• Quimioluminiscencia: Es un fenómeno luminiscente que se produce en el transcurso de una reacción química.

2. Factores que Influyen en la Fluorescencia y Fosforescencia

Rendimiento Cuántico

El rendimiento cuántico de la fluorescencia es la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia y el número total de moléculas excitadas. También se puede definir como la relación entre los fotones emitidos ($I_e$) y los absorbidos ($I_o$):

$$\Phi = \frac{Nº \text{ moléculas emitidas}}{Nº \text{ moléculas excitadas}} = \frac{I_e}{I_o}$$

El resultado está entre 0 y 1.

Factores Intrínsecos y Extrínsecos

• Tipo de transición: Depende de la relajación entre niveles (orbitales).
• Estructura molecular: Los compuestos aromáticos presentan mejor fluorescencia. La rigidez estructural favorece la fluorescencia.
• Condiciones de medida:
  • La temperatura de medida y la presencia de compuestos pesados en el disolvente se relacionan de forma inversa con la fluorescencia.
  • El pH afecta la fluorescencia dependiendo de la ionización de sus radicales ácidos o básicos.
  • La presencia de oxígeno disuelto reduce la intensidad de la fluorescencia.
  • La potencia de la fluorescencia suele ser lineal a bajas concentraciones de la especie fluorescente, perdiéndose la linealidad al aumentar la concentración.

3. Instrumentación Fluorimétrica

Para medir la fluorescencia emitida por una sustancia tras incidir luz de una longitud de onda determinada, se emplean fluorímetros (utilizan filtros como sistema de selección de longitud de onda) o espectrofluorímetros (emplean prismas o redes de difracción para la selección de la longitud de onda tanto de la luz incidente como de la emitida). Generalmente, tienen óptica de doble haz para compensar posibles variaciones de potencia de la lámpara.

Componentes Principales

1. Fuente de luz de excitación: Se emplean lámparas de arco de xenón o lámparas de mercurio (más prácticas por emitir líneas de alta intensidad en el rango de excitación apropiado). También se utiliza el láser de nitrógeno.
2. Rendijas de excitación (a) y emisión (b): Son similares a las de los espectrofotómetros.
3. Monocromador de excitación (a) y emisión (b): Su finalidad es seleccionar la longitud de onda de excitación adecuada y eliminar las longitudes de onda no deseadas emitidas (procedentes de reflexiones y dispersiones) antes de llegar al detector. Pueden ser filtros de vidrio o de interferencia (fluorímetros), o prismas o redes de difracción (espectrofluorímetros).
4. Cubeta para muestras: Deben ser de sílice o de cuarzo. No se pueden utilizar las de plástico, ya que pueden originar una fluorescencia adicional y el método pierde sensibilidad.
5. Sistema de atenuación: El haz de referencia atraviesa el sistema de atenuación que reduce la potencia del haz hasta valores similares a los de la emisión fluorescente.
6. Detector de la muestra (6) y detector de referencia (7): Son, como en los espectrofotómetros, tubos fotomultiplicadores que permiten multiplicar y cuantificar la señal fluorescente. El monocromador de emisión y el fotomultiplicador se sitúan en un ángulo de 90º respecto a la energía incidente para evitar que incida luz procedente de la lámpara.

Explicación del Proceso

La radiación atraviesa el monocromador de excitación, separándose en dos al incidir sobre un espejo. Parte de la radiación atraviesa la cubeta con la muestra llegando al monocromador de emisión y al detector. El haz de referencia atraviesa el sistema de atenuación y el monocromador de emisión de referencia hasta el detector de referencia. El procesador mide la relación existente entre la intensidad de la radiación emitida por la muestra y la de referencia, obteniendo un dato numérico.

4. Aspectos Prácticos de la Fluorimetría

Tipos de Determinaciones Fluorimétricas

Las determinaciones fluorimétricas pueden ser:

• Directas: Se mide la fluorescencia de un compuesto (reactivo + analito).
• Indirectas: Miden el aumento o disminución de la fluorescencia del analito cuando reacciona con los reactivos.

Métodos Fosforimétricos

Los métodos analíticos fosforimétricos se emplean en la determinación de ácidos nucleicos, aminoácidos, purinas, enzimas, etc. No se emplean tanto como la fluorimetría porque, a pesar de su elevada selectividad, presentan mayor imprecisión e inconvenientes en la medida.

Ambas técnicas, la fluorimetría y la fosforimetría, se emplean como complemento a las técnicas de cromatografía líquida de elevada resolución (HPLC) al detectar los componentes luminiscentes que son eluidos a través de una columna cromatográfica.

Sensibilidad y Calibración

• Sensibilidad y especificidad: Es una técnica entre 100 y 1000 veces más sensible que las colorimétricas. En las medidas de absorción, la sensibilidad depende de la proporción de luz absorbida (cantidad de cromógeno y longitud de paso de luz), mientras que en las medidas de fluorescencia depende además de estos factores de la intensidad de la fuente de luz.
• Medida de fluorescencia: Se expresa en unidades de intensidad relativa, pues la intensidad medida no es una cantidad absoluta.
• Las variaciones en la intensidad de radiación hacen necesario el calibrado diario del fluorímetro o del espectrofluorímetro.
• Establecimiento del cero: Para hacer el blanco de reactivo, solo se puede establecer el cero o fluorescencia nula; no existe un equivalente para establecer el 100% de absorción. Por ello, la señal electrónica variará para la misma concentración de sustancia entre instrumentos, y no se podrán comparar. Esto es importante a la hora de realizar controles de calidad, pues no se pueden realizar controles externos.

Consideraciones sobre las Cubetas

Además de ser de sílice o cuarzo, las cubetas:

• No deben presentar ralladuras, porque aumentan la dispersión de la luz.
• No deben tener marcas de dedos, porque se puede producir fluorescencia contaminante o absorción de luz.
• No deben limpiarse con detergentes fluorescentes (se pueden limpiar con ácido nítrico en caliente).

Condiciones que Influyen en la Determinación

• Solvente
• pH
• Temperatura
• Absorbancia de la luz por la solución
• Presencia de interferentes que pueden provocar una fluorescencia no deseada.
• Compuestos que atrapan la luz «atenuación de la fluorescencia o quenching

NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA

1. Fundamentos de la Dispersión Lumínica

Cuando un haz de luz atraviesa una suspensión, parte de la luz es absorbida ($I_a$), parte es reflejada ($I_r$), parte es dispersada ($I_d$) y parte es transmitida ($I_t$):

$$I_o = I_a + I_r + I_d + I_t$$

La nefelometría y la turbidimetría son técnicas relacionadas con la espectroscopía de absorción molecular en el espectro de la luz visible. En ellas se mide la radiación dispersada (nefelometría) o la radiación transmitida (turbidimetría) por la muestra que contiene partículas no transparentes en suspensión en el seno de un líquido.

• La turbidimetría mide la radiación bloqueada por las partículas de la muestra, relacionando la intensidad de la luz incidente sobre la muestra y la intensidad de la luz transmitida.
• La nefelometría mide la radiación dispersada por las partículas de la muestra; por tanto, el detector se sitúa en ángulos distintos al de la luz incidente.

Factores que Afectan la Luz Dispersada

La cantidad de luz dispersada depende de varios factores:

• Concentración de partículas (analito).
• Volumen, tamaño, peso y número de partículas.
• Longitud de onda de la radiación incidente.
• Distancia del detector a la cubeta.

Turbidimetría

La turbidimetría mide la disminución de la intensidad de un haz incidente cuando pasa a través de una suspensión de partículas y se mide a 0º del haz incidente (en su misma dirección). La disminución de intensidad se puede medir como %T o como absorbancia, por lo que se puede utilizar cualquier espectrofotómetro. La sensibilidad de la técnica depende del espectrofotómetro.

En la turbidimetría se cumple la ley de Lambert-Beer, pero, en la práctica, hay que realizar una recta de calibración partiendo de las transmitancias de varias disoluciones de concentración conocida y, después, por extrapolación, calcular la concentración de la solución problema.

Nefelometría

La nefelometría es la medida de la luz dispersada por las partículas de la muestra en ángulos distintos al de la radiación incidente, generalmente entre 15º y 90º. La medida se realiza en aparatos especialmente diseñados al efecto, los nefelómetros.

2. Instrumentación

1. Fuente de luz: Pueden utilizarse lámparas de cuarzo, halógenas, xenón, de arco de mercurio, filamento de tungsteno y láser helioneón. La ventaja del láser es que emite una radiación de gran intensidad y con un pequeño ancho de banda, por lo que el aparato no necesita colimador debido a que produce haces de luz paralelos.
2. Colimador: Su función es corregir la trayectoria de los haces de luz incidente para que incidan en la muestra de manera paralela, evitando la divergencia.
3. Selector de longitud de onda: Se pueden utilizar filtros o monocromadores; estos tampoco son necesarios si la fuente de luz es láser.
4. Cubeta: Se utilizan las mismas que las de espectrofotometría.
5. Sistema de detección: Consta de tubos fotomultiplicadores que pueden ser fijos (más utilizados en clínica) o móviles. Estos últimos adoptan una determinada posición en función del ángulo de detección seleccionado (de 0º a 90º). La sensibilidad máxima se alcanza situando el detector en posición 0º.
6. Lector: El detector capta una fracción de la luz dispersada y la convierte en una corriente eléctrica que se mide en unidades arbitrarias de intensidad luminosa. Si el aparato lleva un microprocesador que almacena los datos que procesa, puede emitir los resultados directamente en concentraciones.

3. Aspectos Prácticos

Sensibilidad

• En los nefelómetros: La sensibilidad depende de la lectura del blanco (absorción/dispersión de la luz incidente debido a la muestra o a los reactivos utilizados, pero no al analito). A menor lectura del blanco de reacción, mayor sensibilidad.
• En los turbidímetros: La sensibilidad depende de las características fotométricas del aparato. Cuanto mayor sea la capacidad de detectar pequeñas variaciones en la absorción, mayor sensibilidad.

Interferencias

Las partículas que se encuentran como componentes del reactivo, al igual que las del suero, pueden dar origen a una dispersión de la luz que interfiere en los resultados de la técnica, como por ejemplo la presencia de lipoproteínas y quilomicrones en sueros lipémicos. La forma de evitar este problema es mediante la utilización de técnicas cinéticas.

Igualmente, hay que prestar atención a una limpieza cuidadosa de las cubetas y la adecuada conservación y manejo de los reactivos que, en caso contrario, favorecerá la dispersión de la luz y con ello se obtendrán resultados erróneos.

Longitud de Onda

El suero contiene, además del analito, otros componentes que absorben luz a determinadas longitudes de onda; por ejemplo, las proteínas tienen un pico de absorción por debajo de 300 nm y los cromógenos del suero entre 400-425 nm. Debido a la presencia de estas sustancias, debemos trabajar con longitudes de onda entre 320-380 nm y 500-600 nm.

En las determinaciones nefelométricas, la dilución del suero reduce la absorción del blanco. Por ejemplo, en las determinaciones basadas en la cuantificación de complejos antígeno-anticuerpo, la utilización de anticuerpos con gran afinidad con el antígeno permite solucionar este problema.

Tipos de Análisis

Se utilizan 2 tipos básicos de medición de la dispersión luminosa en las reacciones antígeno-anticuerpo, aplicables tanto en turbidimetría como en nefelometría:

• Análisis a punto final: Requiere la utilización del blanco y debe transcurrir un tiempo prudencial para la determinación final.
• Análisis de velocidad o cinético: Estudia el cambio de velocidad de la reacción y no requiere blanco.

En el proceso de formación de complejos antígeno-anticuerpo, encontramos una primera etapa donde la formación del complejo es lenta y no hay casi variación en la dispersión de la luz; en una segunda etapa la dispersión de la luz aumenta rápidamente y finalmente la dispersión se ralentiza permaneciendo casi constante.

Uso de Coloides Protectores

En estas técnicas se trabaja con suspensiones con el objetivo de que sean homogéneas y estables. Es aconsejable el uso de coloides como el polietilenglicol para aumentar la estabilidad en el tiempo de la suspensión y así poder reproducir con exactitud los resultados.

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