Fundamentos de la Electroforesis

1. Definición

La electroforesis es el desplazamiento, migración o transporte de partículas cargadas eléctricamente en el seno de una masa líquida, bajo la acción de un campo eléctrico.

2. Principios Físicos Básicos

Para comprender la electroforesis, es útil repasar conceptos básicos de electricidad, como la diferencia entre electricidad estática y corriente eléctrica, y comparar las fuerzas gravitatorias con las electromagnéticas, que son las que impulsan el proceso.

3. Movilidad Electroforética

Definimos la movilidad electroforética (μ) como la velocidad de desplazamiento (v) con la que se mueve una partícula bajo la acción de un campo eléctrico (E) con un gradiente de potencial determinado. Se expresa con la fórmula: μ = v/E.

La movilidad electroforética es una característica intrínseca de cada sustancia en unas condiciones ambientales específicas (como el pH), ya que estas determinan la carga de las partículas. Es independiente del campo eléctrico aplicado, puesto que al variar este, la velocidad de migración varía proporcionalmente.

Factores que Influyen en la Electroforesis

Los principales parámetros que afectan el desarrollo de una electroforesis y que condicionan su utilidad en el laboratorio son:

• La carga neta de las moléculas.
• La fuerza iónica del tampón.
• La estructura y el tamaño de las moléculas.
• El potencial eléctrico y la intensidad de corriente.
• El tipo de soporte utilizado.
• El método de revelado.
• La evaporación del tampón.
• La posible desnaturalización de las partículas.

Análisis de los Factores Clave

La Carga Neta

La carga neta de las partículas depende del pH de la disolución y de sus constantes de equilibrio. Este factor se controla mediante una disolución tampón. En el caso de las proteínas, se suele usar un tampón básico para que la mayoría adquieran una carga neta negativa. Los puntos isoeléctricos de los aminoácidos varían entre 3 y 10; en disoluciones muy ácidas, los aminoácidos actúan como cationes (+), y en disoluciones muy básicas, como aniones (-).

La Fuerza Iónica

La fuerza iónica (I) se calcula como: I = ½ Σ(concentración · carga²). En un proceso electroforético, la corriente es transportada por todos los iones presentes. La mayoría de estos iones provienen del tampón. Cuanto más concentrado sea el tampón, mayor será la proporción de corriente que transporta, y menor la transportada por la muestra, lo que ralentiza el proceso.

Estructura y Tamaño de las Partículas

Este factor es crucial cuando el soporte permite un paso selectivo de moléculas según su tamaño (efecto de tamiz molecular). Lejos de ser un inconveniente, esta propiedad permite separar diferentes tipos de partículas con mayor resolución. En la práctica, no existe ningún soporte que sea estrictamente no restrictivo.

Potencial del Campo Eléctrico

A mayor potencial eléctrico, mayor es la movilidad y, por tanto, la velocidad de migración. Sin embargo, un potencial elevado aumenta la temperatura, lo que puede provocar dos consecuencias no deseadas:

• Evaporación del tampón: Aumenta su concentración y, como resultado, disminuye la velocidad de migración.
• Desnaturalización de las partículas: El calor puede alterar la estructura de biomoléculas sensibles, como las proteínas.

Tipos de Técnicas Electroforéticas

Históricamente, las técnicas de electroforesis se dividían en dos grandes grupos: de interfase libre y de zona. Actualmente, es más práctico clasificarlas según el soporte, el voltaje y otros requerimientos específicos.

Electroforesis de Interfase Libre

Fue el primer método desarrollado. Se realiza en un tubo en forma de U donde se introducen las sustancias a separar. Al conectar los electrodos, las partículas migran hacia los polos opuestos. Hoy en día está en desuso porque no define claramente la separación entre las distintas partículas.

Electroforesis de Zona

En esta modalidad, la muestra se desplaza en un medio líquido adsorbido sobre un soporte sólido. La clasificación se basa en la naturaleza de este soporte.

Soportes No Restrictivos

Permiten que las sustancias se muevan libremente, por lo que la separación ocurre principalmente debido a su carga eléctrica. Ejemplos:

• Papel: Un soporte clásico y sencillo.
• Acetato de celulosa: Se utiliza en forma de tiras porosas. Antes de su uso, se sumergen en el tampón, que ocupa los huecos y conduce la corriente. Sus ventajas son su fácil manejo, rápida ejecución, bajo coste y lectura sencilla.
• Gel de agarosa (baja concentración): A concentraciones bajas (0.5-1 g por 100 cm³ de tampón), actúa como un soporte casi no restrictivo. Es transparente, lo que permite su análisis por fotodensitometría.

Soportes Restrictivos

El soporte ejerce un efecto de tamiz molecular, impidiendo el desplazamiento de las partículas según su tamaño y forma, además de su carga. La separación depende del tamaño del poro del gel. Los dos tipos fundamentales son:

• Gel de almidón: Aunque aumenta el número de fracciones separadas, presenta inconvenientes como la preparación extemporánea y complicada del gel y la dificultad para obtener una porosidad uniforme, lo que impide la densitometría.
• Gel de poliacrilamida: Es el soporte ideal para conseguir separaciones de alta resolución. Se forma por la polimerización de acrilamida y bisacrilamida. Permite variar el tamaño del poro cambiando la composición del gel, proporcionando más fracciones y bandas mejor definidas.

Proceso General e Instrumental

El procedimiento de una electroforesis de zona consta de varias etapas clave:

1. Preparación de la muestra: Las muestras más comunes son suero, plasma, sangre total, orina y líquido cefalorraquídeo. Mientras que el suero y el plasma no suelen necesitar preparación, otras muestras sí. Por ejemplo, para la electroforesis de hemoglobina se requiere un hemolizado de hematíes, y las proteínas urinarias deben concentrarse previamente.
2. Selección del soporte: Se elige el soporte más adecuado (papel, acetato de celulosa, gel de agarosa, gel de poliacrilamida) en función de las moléculas que se desean separar.
3. Aplicación de la muestra: La muestra se puede aplicar de varias formas:
   • Sobre la superficie del soporte, dejando que penetre por capilaridad.
   • En orificios o ranuras previamente hechos en los geles.
   • Incluyéndola durante el proceso de polimerización del gel.
4. Proceso electroforético: Se lleva a cabo con el siguiente instrumental:
   • Fuente de alimentación: Proporciona la energía eléctrica necesaria para crear el campo eléctrico.
   • Cubeta de electroforesis: Es una cámara que contiene los electrodos de carga opuesta en dos receptáculos separados, conectados por un puente salino que permite el paso de la corriente. La cubeta se mantiene tapada para minimizar la evaporación y, en algunos casos, incluye un sistema de refrigeración.
5. Revelado: Su objetivo es localizar las distintas fracciones separadas. Primero, se detiene el proceso de difusión y luego se tiñe la tira con un colorante específico para el compuesto de interés. El exceso de colorante se elimina con lavados en una solución aclarante.
6. Lectura y evaluación: Los resultados se pueden cuantificar de varias maneras:
   • Elución: Se recorta cada zona, se eluye en un disolvente y se mide la absorbancia de la disolución coloreada en un espectrofotómetro.
   • Densitometría: Se realiza una lectura directa de la tira con un fotodensitómetro. Un haz de luz atraviesa la tira y un detector mide la luz transmitida, que es inversamente proporcional a la densidad de color de cada fracción. El resultado es una gráfica donde cada banda aparece como un pico.
   • Escintilometría: Se utiliza cuando la muestra es radiactiva.
   • Identificación por fluorescencia: Se emplea si las moléculas han sido marcadas con fluorocromos.

Aplicaciones de la Electroforesis

La electroforesis es una técnica fundamental para el análisis de biomoléculas como proteínas, ADN, ARN, así como antibióticos y vacunas. La elección del soporte es clave para cada aplicación.

En la electroforesis de proteínas séricas en acetato de celulosa, se obtienen varias fracciones (albúmina, alfa, beta y gamma globulinas). Salvo la albúmina, cada fracción agrupa un conjunto de proteínas con movilidad similar. Si se utiliza plasma en lugar de suero, aparece una banda adicional de fibrinógeno entre las fracciones beta y gamma.

Consideraciones Prácticas y Problemas Comunes

• Problemas con el tampón: El tampón se contamina fácilmente, por lo que debe guardarse refrigerado (4°C). Los volúmenes pequeños deben desecharse tras su uso para evitar la contaminación cruzada.
• Fuente de alimentación y cubetas: La cubeta debe estar nivelada horizontalmente, con los receptáculos llenos de tampón por igual. Los extremos del soporte deben estar bien impregnados. Es fundamental mantener las cubetas limpias y tapadas.
• Aplicación de la muestra: Los aplicadores deben estar perfectamente limpios. Es crucial respetar la cantidad de muestra indicada en el protocolo para obtener resultados reproducibles.
• Voltaje y calentamiento: Un voltaje elevado aumenta la velocidad, pero también genera calor. Este calentamiento puede provocar la desecación de los bordes del soporte, resultando en una migración más lenta en esas zonas y la aparición de «bandas arqueadas».
• Tinción y lectura: Para una correcta lectura por fotodensitometría, el fondo de la tira o gel debe ser transparente y uniforme tras la tinción y el aclarado.

Técnicas Electroforéticas Avanzadas

Isoelectroenfoque (IEF)

Es una técnica de alta resolución que separa las moléculas, típicamente proteínas, según su punto isoeléctrico (pI). A diferencia de la electroforesis convencional, se utiliza un soporte (generalmente un gel) que contiene un gradiente de pH estable.

Cuando una molécula migra a través del gel por la acción del campo eléctrico, llega a una zona donde el pH del medio es igual a su pI. En ese punto, su carga neta se vuelve nula y deja de migrar. Esto produce un «enfoque» de las moléculas en bandas muy nítidas y definidas.

• Ventajas: Ofrece una resolución muy superior a la electroforesis estándar, permitiendo separar compuestos con diferencias de pI de tan solo 0.02 unidades.
• Inconvenientes: Requiere diferencias de potencial muy altas (hasta 2000 voltios), lo que obliga a usar sistemas de refrigeración para disipar el calor generado.
• Tampones especiales: Se utilizan anfolitos sintéticos (mezclas de tampones poliaminopolicarboxílicos) o inmovilinas (copolímeros insolubilizados en el gel) para generar el gradiente de pH.
• Aplicaciones: Separación de isoformas de proteínas como la α1-antitripsina, determinación de variantes de hemoglobina, estudio de inmunoglobulinas y análisis de alimentos.

Electroforesis de Flujo Libre

En esta técnica, la muestra se inyecta de forma continua en una cortina líquida de tampón que fluye. Perpendicularmente a este flujo, se aplica un campo eléctrico. Los componentes de la muestra se separan lateralmente según su movilidad electroforética y se recogen de forma continua en diferentes orificios de salida.

• Aplicaciones: Purificación de lipoproteínas de alta densidad (HDL), separación de poblaciones celulares como linfocitos T y B, y purificación de enzimas como el activador tisular del plasminógeno (t-PA).

Electroforesis Capilar (CE)

Es una técnica alternativa que permite usar potenciales eléctricos muy altos, aumentando drásticamente la velocidad y la eficiencia de la separación. La electroforesis se realiza en un tubo capilar de sílice fundida con un diámetro interno muy pequeño (inferior a 0.1 mm) y una longitud de 50 cm a 1 m.

• Ventajas:
  • Requiere volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0.1 a 10 nL).
  • Ofrece una elevada resolución y rapidez.
  • Es fácilmente automatizable.
  • Elimina el uso de disolventes orgánicos tóxicos y costosos, comunes en técnicas como la HPLC, ya que emplea soluciones acuosas.
• Detección: Se pueden utilizar detectores cuantitativos similares a los de la HPLC. El resultado es un electroferograma, donde cada compuesto separado aparece como un pico.

Modalidades de Electroforesis Capilar:

• Electroforesis Capilar de Zona (CZE): Basada en la separación de los analitos según su relación carga/tamaño.
• Electroforesis Capilar en Gel (CGE): Combina la migración electroforética con el tamizado molecular de un gel dentro del capilar, permitiendo separar por peso molecular.
• Enfoque Isoeléctrico Capilar (cIEF): Adapta la técnica de isoelectroenfoque al formato capilar.
• Isotacoforesis: Técnica de desplazamiento donde los analitos migran a velocidad uniforme, formando zonas contiguas.
• Electrocromatografía Capilar (CEC): Un híbrido entre la HPLC y la electroforesis capilar.

Técnicas de Electroforesis en Gel

Las electroforesis en gel son fundamentales en biología molecular. El criterio de separación principal suele ser el tamaño de las moléculas, ya que se trabaja en condiciones que anulan o uniformizan las diferencias de carga.

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE)

El gel de poliacrilamida es un soporte químicamente inerte, transparente y estable, cuyo tamaño de poro se puede controlar variando la concentración de acrilamida y bisacrilamida. Se emplea para separar proteínas y fragmentos pequeños de ADN.

• PAGE en condiciones no desnaturalizantes (Nativa): La separación se realiza manteniendo la conformación nativa y la actividad biológica de las proteínas. Esto permite realizar estudios de funcionalidad (actividad enzimática, unión a anticuerpos) tras la separación.
• PAGE en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE): Es la técnica más común para separar proteínas por peso molecular. Se utiliza el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que desnaturaliza las proteínas y les confiere una carga negativa uniforme y proporcional a su masa. De este modo, los complejos SDS-proteína migran a través del gel separándose estrictamente según su tamaño.

Electroforesis en Geles de Agarosa

La agarosa es un polisacárido que forma un gel con poros de mayor tamaño que la poliacrilamida. Por ello, se utiliza para separar moléculas grandes, especialmente fragmentos de ADN de más de unos cientos de pares de bases hasta aproximadamente 20,000. La concentración del gel (normalmente entre 0.5% y 2%) determina el tamaño del poro y el rango de separación.

Electroforesis Bidimensional (2D)

Esta potente técnica separa mezclas complejas de proteínas según dos propiedades moleculares independientes, una en cada dimensión. El procedimiento más común combina:

1. Primera dimensión: Isoelectroenfoque (IEF), que separa las proteínas por su punto isoeléctrico (pI).
2. Segunda dimensión: SDS-PAGE, que separa las proteínas (ya separadas por pI) según su peso molecular.

Electroforesis en Geles de Gradiente

Se utilizan geles de poliacrilamida con un gradiente creciente de concentración, lo que crea un gradiente decreciente en el tamaño del poro. Las proteínas migran hasta alcanzar una zona donde el tamaño del poro impide su avance (límite de poro), mejorando la resolución de las bandas.

Electroforesis en Campo Pulsante (PFGE)

Esta técnica (del inglés, Pulsed-Field Gel Electrophoresis) se emplea para separar moléculas de ADN extremadamente grandes (cromosomas enteros). Se utilizan geles de agarosa de baja concentración y se altera periódicamente la orientación del campo eléctrico. Este cambio constante de dirección obliga a las moléculas a reorientarse para avanzar, un proceso que es más lento para las moléculas más grandes, permitiendo así su separación.

Etiquetas: análisis de ADN, Biología Molecular, Electroforesis, gel de agarosa, PAGE, separación de proteínas, técnicas de laboratorio