La Clonación: Fundamentos y Proceso

La clonación se define como el proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc, basado en la tecnología de ADN recombinante. Este procedimiento consiste en crear moléculas de ADN recombinante (ADNre) que serán introducidas en una célula huésped. Mediante la multiplicación de estas células en cultivo, se consiguen múltiples copias del ADNre y del fragmento amplificado de interés.

Vectores de Clonación

Los vectores son moléculas de ADN que pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y que permiten la inserción de ADN extraño sin perder dicha capacidad de replicación. Para ser efectivos, deben cumplir los siguientes requisitos:

• Origen de replicación: Permite que el vector se replique en la célula huésped junto con el fragmento de ADN extraño.
• Sitio de inserción: Contiene secuencias diana de enzimas de restricción. Generalmente, estas dianas se concentran en un segmento corto denominado polylinker o sitio de multiclonación.
• Marcador de selección: Permite distinguir las células que portan el vector de aquellas que no lo han incorporado.
• Marcador de identificación: Permite distinguir las células que portan un vector recombinante (con el ADN extraño insertado) de aquellas que portan un vector original sin inserto.

Tipos de Vectores según su Capacidad y Origen

1. Plásmidos

Son moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación. Sus características principales son el tamaño del inserto que pueden transportar y el número de copias por célula. Ejemplos notables incluyen:

• pBR322: Transporta fragmentos de ADN y alcanza unas 20 copias por célula.
• pUC18: Permite insertos de hasta 10 kb y destaca por su alta tasa de replicación.

2. Bacteriófagos

Son virus que infectan bacterias. Su utilización como vector implica la sustitución de la región central del genoma viral por ADN extraño. Destacan:

• M13: Permite insertos de hasta 20 kb.
• Fago Lambda (λ): Se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de restricción; con la misma enzima se corta el fragmento de ADN de interés y se unen mediante una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago y se introducen en células hospedadoras bacterianas. Dentro de los mismos, los vectores se replican formando copias del fago infectivo con el fragmento de interés. Pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb.

El ciclo biológico de estos virus puede ser:

• Ciclo lítico: El virus se une a la célula hospedadora, introduce su ADN, se produce la síntesis de ARN y proteínas virales, y finalmente los viriones salen de la célula provocando su lisis.
• Ciclo lisogénico: El virus introduce su ácido nucleico, el cual se integra en el ADN bacteriano (prófago) y permanece inactivo hasta que un cambio ambiental induce su liberación para continuar con el ciclo lítico.

3. Cosmidos y Fagémidos

• Cosmidos (ej. pJB8): Vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago lambda (sitios cos) y parte de un plásmido bacteriano (origen de replicación, genes de resistencia a antibióticos y polylinker). Tienen capacidad para unos 50 kb.
• Fagémidos: Vectores híbridos compuestos por un plásmido al que se le inserta el origen de replicación de un fago M13, manteniendo las utilidades de los plásmidos con la capacidad de producir ADN monocatenario.

4. Cromosomas Artificiales

Vectores de alta capacidad diseñados para transportar fragmentos de ADN de gran tamaño:

• BAC (Cromosomas Artificiales Bacterianos): Insertos de hasta 300 kb.
• YAC (Cromosomas Artificiales de Levadura): Capacidad de hasta 1 Mb.

5. Vectores Lanzadera

Vectores híbridos que contienen orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes, como un plásmido bacteriano y una levadura o un virus animal (como el SV40).

Células Hospedadoras

Son los organismos donde se introduce el vector de clonación para su amplificación. Se dividen en:

• Bacterianas (E. coli): Son las más utilizadas debido a su fácil manipulación, el uso de cepas defectivas y su alta tasa de replicación.
• Eucariotas: Incluyen levaduras (S. cerevisiae), células vegetales (mediante el plásmido de Agrobacterium tumefaciens) y células animales (utilizando vectores víricos como retrovirus de mamíferos).

Fases de la Clonación Génica

Fase 1: Creación de un Vector Recombinante

Consiste en la unión del inserto de ADN extraño con el vector mediante una ligasa, creando extremos cohesivos y complementarios. El proceso incluye:

• Preparación del ADN: Fragmentación del ADN que se va a clonar.
• Preparación del vector: Digestión con la misma enzima de restricción. Puede ser:
  • Vector circular con diana única (genera una molécula lineal con extremos cohesivos, común en plásmidos).
  • Vector circular con dos dianas (genera dos moléculas lineales: una grande con marcadores genéticos y una pequeña que se sustituye).
  • Vector lineal con diana única (genera dos brazos, izquierdo y derecho).
  • Vector lineal con dos dianas (como el fago lambda, con dos brazos y una región central sustituible).
• Inserción: Mezcla de ADN y vector para que se unan por sus extremos mediante la ADN ligasa.

Fase 2: Introducción del Vector en la Célula Hospedadora

Existen diversos métodos para introducir el ADN recombinante:

• Transformación bacteriana: Captación de ADN desnudo del medio. Las bacterias se hacen competentes mediante tratamientos químicos (cloruro cálcico) y físicos (choque térmico) para aumentar la permeabilidad de la membrana.
• Transfección: Introducción de vectores en células eucariotas no mediada por virus. Se usan agentes químicos como el fosfato cálcico (coprecipitación y endocitosis) o liposomas (fusión de membranas).
• Transducción: Introducción de material genético mediante la acción de un virus que empaqueta el vector recombinante.
• Electroporación: Aplicación de pulsos eléctricos de alto voltaje para crear poros temporales en la membrana celular.

Fase 3: Selección e Identificación de Clones Recombinantes

Para verificar el éxito del proceso se utilizan diversos sistemas:

• Genes de resistencia a antibióticos: Se usan genes como los de resistencia a la ampicilina o tetraciclina. Si el inserto se coloca dentro de un gen de resistencia, este se inactiva, permitiendo identificar los recombinantes por su sensibilidad al antibiótico.
• Estrategia cromogénica (Screening azul/blanco): Utiliza bacterias lac- y vectores con el gen LacZα. En presencia de inductor IPTG y sustrato X-gal, las colonias azules no son recombinantes (Lac+), mientras que las blancas contienen el vector recombinante (Lac-).
• Proteínas fluorescentes: Uso de genes como la GFP. Las bacterias con plásmidos no recombinantes emiten fluorescencia, mientras que las recombinantes (con el gen interrumpido) no lo hacen.
• Genes letales: El vector contiene un gen que codifica una proteína letal en el sitio de inserción; solo sobreviven las células que han incorporado el inserto, ya que este interrumpe la expresión de la toxina.

Bibliotecas de ADN

Una biblioteca es una colección de vectores recombinantes que contienen secuencias de ADN derivadas de un único organismo o tejido. Se clasifican en:

• Bibliotecas genómicas: Incluyen el genoma completo de un organismo.
• Bibliotecas cromosómicas: Construidas a partir de un único cromosoma o fracción del mismo.
• Bibliotecas de ADNc: Creadas a partir del ARNm de un tejido específico mediante transcripción inversa con retrotranscriptasa.

Para su estudio se emplean técnicas de hibridación (identificación del clon), paseo cromosómico (secuencias consecutivas) y secuenciación.

Aplicaciones de la Tecnología Recombinante

La clonación y el ADN recombinante tienen un impacto vital en diversos sectores:

• Productos terapéuticos: Fabricación de insulina humana, hormona del crecimiento y factores de coagulación.
• Terapia génica: Tratamientos contra enfermedades como la inmunodeficiencia combinada grave.
• Agricultura: Desarrollo de alimentos resistentes a plagas y herbicidas (ej. trigo resistente al insecto barrenador) o alimentos nutricionalmente mejorados.
• Control ambiental y de salud: Control de plagas, como el desarrollo de mosquitos resistentes a la transmisión de la malaria.

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