RA3: CITOMETRÍA DE FLUJO

1. FUNDAMENTO

La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico. Su fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de células, alineadas de una en una, por delante de un haz de luz láser focalizado. Sus objetivos principales son:

• Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.
• Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas, lo que se conoce como «electronic cell sorting» (tecnología FACS).
• Medir la capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas.

En esencia, se inyecta una suspensión de células en un líquido capaz de ordenar el flujo celular de manera individual y a gran velocidad. Sobre cada célula incide la luz de al menos un láser, que se transforma en emisiones a diferentes longitudes de onda (diferentes fluorescencias). Algunas de estas emisiones son recogidas por detectores que amplifican las señales y las transforman a formato digital. Toda esta información es integrada en un ordenador para su posterior análisis.

Tipos de parámetros celulares que podemos medir:

• Los intrínsecos, derivados de características morfológicas de la célula, como su tamaño y la complejidad del núcleo y citoplasma.
• Los relacionados con características antigénicas de cada célula, poniendo de manifiesto estructuras localizadas en la membrana, el citoplasma o el núcleo. Este es el inmunofenotipo.

2. COMPONENTES DE UN CITÓMETRO DE FLUJO

Los componentes de un citómetro de flujo se resumen en:

• Sistema de fluidos o hidráulico (inyección de la muestra y cámara de flujo).
• Sistema óptico (fuentes de luz, detectores, espejos y filtros).
• Sistema electrónico/informático (amplificador convertidor analógico/digital y software de adquisición/análisis).

2.1. Sistemas de Fluidos

• Conduce la suspensión celular a una velocidad constante y controlada a través de la cámara de flujo o zona de detección, donde incide el haz de luz.
• Está formado por un capilar por el que pasa un líquido isotónico que envuelve la suspensión, permitiendo la formación de un flujo laminar sin turbulencias.
• Las células viajan centradas y una tras otra en el chorro de inyección.

El sistema hidráulico transporta las células hacia el centro del láser de una en una.

2.2. Sistemas Ópticos

Las fuentes de iluminación pueden ser de diferente tipo y destacan:

• Lámparas de alta luminosidad (de mercurio, xenón).
• Láseres de alta potencia refrigerados por agua o por aire (de argón, de kriptón).

En el sistema también hay filtros, que se usan para eliminar y separar la luz recogida.

2.3. Sistema Electrónico

El sistema electrónico convierte toda la información en señales digitales para almacenarla en el ordenador.

3. LECTURA DE LAS SEÑALES: Parámetros

Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos tipos:

• Señales de dispersión:
  • Tamaño celular (FSC).
  • Complejidad (SSC).
• Señales de fluorescencia.

3.1. Señales de Dispersión

La dispersión se produce cuando la luz interacciona con una partícula y cambia de dirección (no de longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. La dispersión depende de:

• El tamaño celular.
• La membrana celular.
• El núcleo.
• El material granular del interior de la célula, llamado complejidad.

Tipos de Dispersión:

• FSC (Forward Scatter): Es la luz dispersada en un ángulo cónico pequeño (0-10°) que casi coincide con la dirección de la luz incidente. Mide la «penumbra» que genera la célula al pasar por el láser y es proporcional al tamaño de la partícula.
• SSC (Side Scatter): Es la luz dispersada en ángulo recto (90°). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula.

COMPLEJIDAD o GRANULOSIDAD CELULAR (SSC)

Luz dispersada lateralmente a 90°. Nos informa sobre la estructura celular interna.

3.2. Señales de Fluorescencia

• Los fluorocromos son moléculas que aceptan energía lumínica a una determinada longitud de onda (excitación, ej. del láser) y la desprenden a una longitud de onda mayor (emisión).
• Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación, emite energía radiante y se produce un cambio de color.
• Los anticuerpos monoclonales empleados en CMF están conjugados con fluorocromos, de modo que la intensidad de la fluorescencia detectada es directamente proporcional al número de moléculas unidas al antígeno.

SEÑALES DE FLUORESCENCIA

• El fluorocromo absorbe la energía del láser, vibra y emite fotones de una longitud de onda mayor que la del láser.
• La fluorescencia emitida por cada fluorocromo o colorante debida a la excitación del láser es dispersada a 90°.

4. CALIBRACIÓN Y PUESTA A PUNTO DEL CITÓMETRO

La calibración del láser se realiza mediante patrones con valores determinados de fluorescencia o dispersión de la luz. Su finalidad es:

• Maximizar la resolución.
• Establecer el ruido de fondo para eliminarlo de las mediciones.
• Establecer un nivel base para la detección de fluorescencia que permita la posterior discriminación de las poblaciones positivas y negativas.

Se debe realizar un control de calidad diario para monitorizar la reproducibilidad de los reactivos, con controles + y -. También hay que verificar la alineación de cada láser respecto a la celda de flujo.

Mantenimiento preventivo del citómetro:

Antes de comenzar las determinaciones analíticas:

• Poner en marcha el equipo: láser, bomba del tanque de la solución de flujo y ordenador.
• Purgar el equipo y comprobar el nivel de los tanques.

Tras cada ronda de determinaciones analíticas:

• Realizar un lavado corto.

Tras la última determinación analítica:

• Realizar los lavados establecidos.
• Apagar el equipo: bomba del tanque de la solución de flujo, ordenador y láser.

5. REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE POBLACIONES CELULARES. CÁLCULO DE DATOS

Los datos generados por los citómetros de flujo se llaman citogramas o histogramas, y generalmente se presentan sobre un eje de coordenadas X/Y.

Los histogramas pueden ser dibujados:

1. En relación a una sola variable, como es el tamaño de la célula.
2. Como gráficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o más variables.
3. En gráficos tridimensionales (como los contour plot o los dot plot density).

Esto dependerá de sus características físicas de dispersión y antigénicas.

Representaciones Gráficas

• En un histograma monoparamétrico, se representa en el eje X la intensidad de fluorescencia y en el eje Y el número de células que poseen la misma.
• En las representaciones biparamétricas en 2D (dot plot), se representan simultáneamente dos parámetros, clasificando los distintos tipos de células.
• En la representación en 3D (contour-plot o dot-plot density), se representan simultáneamente dos parámetros y un tercero, que es la altura, representando el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros.

En estos gráficos podemos delimitar distintas regiones en función de la intensidad de la fluorescencia emitida por las células. Con esto creamos unos subgrupos celulares, llamados «gates». El «gating» es la separación de estos grupos, normalmente con fines diagnósticos y se usa con mucha frecuencia en el laboratorio.

6. MUESTRAS EMPLEADAS

• Todas las muestras utilizadas para su caracterización por medio de CMF deben ser convertidas en una suspensión celular.
• Estas muestras proceden de: MO (Médula Ósea), sangre periférica, exudados, LCR, tejidos sólidos, células procedentes de cultivos celulares, etc.
• Las muestras irán debidamente identificadas, indicando los datos del paciente, la presunción diagnóstica, el recuento celular diferencial (fórmula leucocitaria) y los resultados de los frotis y la citoquímica realizada.
• Deben procesarse lo antes posible para evitar la pérdida selectiva de antígenos. Trabajar siempre a 4 °C, tratar las células con mucha delicadeza para perder el menor porcentaje posible y filtrar las muestras en filtros de unas 30 micras justo antes de pasar por el citómetro.

7. CELL SORTING (MEDIANTE FACS)

• Es un proceso de separación celular por citometría de flujo.
• Se emplean aparatos especiales en los que se realiza una separación física de las células o partículas, en función de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo convencional.
• La separación se puede hacer por métodos mecánicos, hidráulicos o electrostáticos.
• Los sistemas electrostáticos fraccionan la muestra en pequeñas gotas mediante un sistema de vibración. Cada una de estas gotas lleva una sola célula o está vacía. Si el sistema detecta que en esa gota hay una partícula o célula deseada, le aplica una corriente eléctrica que desvía la trayectoria de la partícula para que caiga en un tubo recolector determinado.

8. APLICACIONES DE LA CMF

Esta técnica tiene muchas aplicaciones, tanto en investigación como en la rutina clínica.

La monitorización de las subpoblaciones linfocitarias tiene especial relevancia, por ejemplo, en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), en el diagnóstico y clasificación de inmunodeficiencias primarias, en la monitorización de enfermedades autoinmunes o en el seguimiento de trasplantes de médula ósea.

Etiquetas: Análisis Celular, citometría de flujo, CMF, FACS, Fluorescencia, FSC, Inmunofenotipo, SSC