Cultivo Continuo y el Quimiostato

El cultivo continuo permite mantener una población bacteriana en fase exponencial durante un periodo prolongado.

El aparato que permite este tipo de cultivos se denomina Quimiostato.

Al cultivo se le agrega continuamente medio fresco y se le elimina constantemente el medio excedente con productos de desecho.

Usos: Se emplean para investigar la influencia de diferentes condiciones ambientales en el crecimiento. Este método se asemeja mucho más a las condiciones de crecimiento de las bacterias in vivo.

Medios de Cultivo

Composición de los Medios de Cultivo

• H₂O (Agua)
• Agentes solidificantes
• Peptonas: Fuente de Carbono (C), Nitrógeno (N) y Azufre (S).
• Carbohidratos: Fuente de Carbono (C) y energía.
• Extractos: De carne o levadura.
• NaCl y Sales minerales.
• Amortiguadores/Indicadores de pH.
• Otros: Bilis y sales biliares, agentes reductores, colorantes, etc.

Agentes Solidificantes

Los agentes solidificantes más comunes son:

• Agar: Polisacárido de algas rojas. Se vuelve líquido entre 80-100 ºC y sólido (gel) al enfriarse.
• Gel de Sílice o Silicagel: Sólido a pH ácido.
• Gelatina

Clasificación Según su Consistencia Física

Medios Líquidos o Caldos

Poseen consistencia líquida. Si existe crecimiento, se observa turbidez.

Medios Sólidos

Contienen aproximadamente 15 g de agar por litro (1,5%). Donde se deposita una bacteria aparece una masa macroscópicamente visible, denominada colonia.

Medios Semisólidos

Contienen entre 4-7 g de agar por litro. Se utilizan para estudiar la movilidad bacteriana o para pruebas bioquímicas.

Clasificación Según su Composición Química

Medios Definidos o Sintéticos

Su composición química exacta es conocida.

Medios Indefinidos o Complejos

Su composición química exacta es desconocida por contener alguna sustancia biológica, por ejemplo: sangre de cordero, extracto de carne o levaduras, infusión cerebro-corazón, etc.

• Su empleo se basa en la experiencia.
• Forman parte de este grupo todos los medios enriquecidos.

Clasificación Según su Función

Generales, Básicos o Comunes

Contienen las sustancias nutritivas mínimas para el crecimiento de bacterias no exigentes.

• Ejemplos: Medio Müller-Hinton, Agar Nutritivo, Agar Triptona Soja, Luria Bertani.

Enriquecidos

Además de los compuestos básicos, se han añadido ciertas sustancias imprescindibles para el desarrollo de microorganismos exigentes en requerimientos nutritivos. En ellos crecen prácticamente todas las bacterias.

• Ejemplos: Agar Sangre, Agar Chocolate (utilizado para microorganismos como Neisseria o Haemophilus).

De Enriquecimiento

Es un medio líquido diseñado para favorecer el crecimiento de un grupo concreto de bacterias mientras desfavorece el crecimiento de las demás. Actúa como un “filtro” biológico.

• Ejemplos: Caldo selenito (favorece Salmonella), caldo tetrationato.

Diferenciales

Incorporan elementos que facilitan la diferenciación de las colonias formadas por uno u otro tipo de bacteria (observando variaciones de color de las colonias).

• Agar Sangre: Diferencia bacterias hemolíticas y no hemolíticas.
• Levine: Brillo metálico (indicativo de E. coli).
• CLED: Utilizado para recuento e identificación de microorganismos de vías urinarias.

Selectivos

Inhiben el crecimiento de unas bacterias permitiendo el desarrollo de otras. Contienen bilis, cristal violeta, antibióticos, etc.

• Ejemplo: Agar MacConkey (impide el crecimiento de Gram positivos).

Medios de Transporte

Permiten la supervivencia de los microorganismos presentes en una muestra patológica durante algún tiempo. Se utilizan para la toma de muestras y transporte al laboratorio.

• Ejemplos: Medio de Stuart o Amies.

Medios de Conservación

Sirven para mantener la viabilidad de los microorganismos durante mucho tiempo en condiciones de baja temperatura (Tº).

• Ejemplos: Leche descremada, glicerol.

Preparación de los Medios de Cultivo

La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones. Solo es necesaria la adición de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes.

Preparación de Medios Líquidos

Cuando se prepara un medio líquido, se deben disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada. A continuación, el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o tubos), se tapan y se esterilizan.

Preparación de Medios Sólidos

La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras:

1. Preparar el caldo y añadir agar al 1,5%.
2. Utilizar un medio sólido comercial.

Independientemente de la forma elegida, la preparación de los medios de cultivo sólidos requiere procedimientos especiales, ya que el agar es insoluble en agua fría. Por ello, una vez añadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100 ºC para permitir que el agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos.

El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y esterilizan.

• Tubos: Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse adopten la forma inclinada que proporciona mayor superficie de siembra (pico de flauta).
• Placas de Petri: Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verterá en placas vacías en un ambiente aséptico, como la proximidad de la llama de un mechero Bunsen o una campana de flujo laminar.

El medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estéril en tubos, que se fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas. Para incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, estos se esterilizarán por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante.

Siembra del Medio de Cultivo

La siembra de microorganismos consiste en inocular o depositar en un medio de cultivo adecuado una cierta cantidad de material microbiológico, procedente de una muestra biológica (siembra primaria) o de un cultivo primario (resiembra), para promover su crecimiento y multiplicación.

Técnicas e Instrumentos de Siembra

Asa de siembra

Se utiliza para tomar pequeñas cantidades de muestra de un cultivo y transferirlas a un nuevo medio. Es esencial para el aislamiento de colonias bacterianas.

Hilo de siembra

Similar al asa de siembra, pero con un extremo en forma de hilo. Se usa para inocular microorganismos en medios de cultivo sólidos, especialmente en tubos de agar profundo para determinar la motilidad bacteriana.

Pipeta Pasteur

Se utiliza para transferir líquidos en pequeñas cantidades. Aunque no es un instrumento específico para la siembra, puede utilizarse para añadir inóculo a un medio de cultivo.

Asa de Drigalski (o Cayado)

Se utiliza para extender uniformemente una muestra líquida sobre la superficie de un medio de cultivo sólido en una placa de Petri. Facilita la distribución homogénea de los microorganismos.

Siembra en Medios Líquidos

Manejo del asa de siembra durante una inoculación:

1. El asa se coge de la mano como si fuera un lápiz.
2. La boca del tubo se flamea después de abrir y antes de cerrar.

3. El tapón se maneja con el meñique de la mano derecha.
4. Toda operación se realiza cerca del mechero Bunsen.

Siembra en Medio Líquido o Inoculación de un Caldo (Siembra “por Dilución”)

Siembra por Extensión en Superficie en Tubos de Agar Inclinado

Siembra Masiva por Extensión en Superficie en Placas de Petri

Siembra por Dilución en Masa o Inclusión en Agar

Incubación de los Medios de Cultivo

Estufas de Cultivo

• Las placas deben colocarse invertidas.
• Los medios deben estar separados entre sí y de las paredes.
• Temperatura: 35-37 ºC.
• Humedad: 75%.
• Tiempo: 18-24 horas.
• Se requiere una atmósfera adecuada.

Cultivo en Anaerobiosis

Se utiliza un recipiente con una tapadera que lleva incorporado un catalizador de paladio. Se introducen los cultivos junto a un sobre de Gas-Pak que contiene una tableta de borohidruro sódico y otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico. Se le añade al sobre 10 ml de agua, generándose CO₂.

Para confirmar la anaerobiosis, se coloca dentro de la jarra un papel indicador que vira de color en presencia de CO₂.

Hemocultivos

Anteriormente, los hemocultivos se procesaban de forma manual y se utilizaban frascos con medio bifásico de Ruiz Castañeda. Actualmente, han sido sustituidos en los laboratorios clínicos por sistemas automatizados de lectura continua que han demostrado mayor eficiencia.

Los frascos se introducen en sistemas de incubación automatizados (diferentes según la compañía empleada) que mantienen la temperatura a unos 36 ± 1 ºC. Estos sistemas constan de una serie de celdas individuales con agitación continua para facilitar la multiplicación bacteriana y realizan una monitorización periódica para la detección de frascos positivos.

Sistemas Automatizados Avanzados

• Sistema BacT/Alert® VIRTUOTM: Permite incubar, agitar y controlar continuamente el crecimiento de microorganismos aerobios, facultativos y anaerobios. Detecta el crecimiento bacteriano porque este ocasiona un aumento en la producción de CO₂ en el medio y, por lo tanto, una modificación del pH que se traduce en un cambio de color en el sensor de la base.
• Sistema BD BACTEC: Dispone de un sensor fluorimétrico de gases integrado en el vial del hemocultivo. Los fotodetectores presentes en cada una de las estaciones del instrumento miden el nivel de fluorescencia emitido por cada vial, que se corresponde con la cantidad de CO₂ liberado por los microorganismos. También dispone de un sistema para controlar el volumen de sangre inoculada.

Tipos de Frascos de Hemocultivos

Existen frascos diseñados para el aislamiento de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, y frascos para el aislamiento de anaerobios facultativos y estrictos. También existen frascos optimizados para pequeños volúmenes de sangre, útiles en pediatría, y los selectivos para micobacterias (medio Middlebrook 7H9) u hongos, que se pueden utilizar en casos específicos.

Los frascos contienen medios de cultivo enriquecidos con diferentes nutrientes que utilizan como anticoagulante SPS (Polianetol Sulfonato de Sodio). El SPS es capaz de neutralizar la actividad bactericida del suero e inhibir la acción de algunos antibióticos que pueden interferir en el crecimiento de algunas especies bacterianas de los géneros Neisseria spp., Streptococcus spp. y Gardnerella spp.

Como frecuentemente los hemocultivos se extraen en pacientes que están recibiendo tratamiento antibiótico, se emplean partículas de carbón o resinas para neutralizar el efecto de los mismos. Las resinas, además, están diseñadas para neutralizar los componentes de la cascada del complemento presentes en la sangre. Algunos medios de crecimiento incorporan agentes líticos que favorecen la recuperación de microorganismos incluidos en el interior de los fagocitos.

Preguntas de Repaso y Conceptos Clave

Test de Conocimientos

1. ¿En qué medio de cultivo las sales biliares y el cristal violeta actúan de agentes selectivos?
   Respuesta: Agar MacConkey.
2. ¿Qué aportan principalmente las peptonas entre los distintos componentes de un medio de cultivo?
   Respuesta: Fuente de Carbono, Nitrógeno y Azufre.
3. ¿Cuál es el tiempo de generación medio para patógenos habituales?
   Respuesta: 15 a 30 minutos.
4. La mayoría de las bacterias de interés clínico son:
   Respuesta: Mesófilas.
5. La concentración de agar de un medio de cultivo sólido es:
   Respuesta: 15 g/L (1,5%).
6. ¿Para qué se usa en bacteriología la leche descremada o el glicerol?
   Respuesta: Como medios de conservación.
7. ¿Qué fase del crecimiento bacteriano en un medio de cultivo cerrado se corresponde con la fase de infección aguda?
   Respuesta: Fase exponencial.
8. ¿Cómo clasificamos a un agar nutritivo?
   Respuesta: Sólido, general, no diferencial.
9. ¿Qué componente del medio específico para hemocultivos inhibe o neutraliza la acción bactericida del suero?
   Respuesta: Anticoagulante SPS y resinas.

Conceptos Adicionales

1. Diferencia entre Anaerobios Facultativos y Aerotolerantes

Ambos corresponden a unas condiciones fisicoquímicas para el desarrollo de los microorganismos, en este caso respecto al O₂. Se diferencian en:

• Anaerobios Facultativos: No necesitan el O₂ para su normal crecimiento, pero si está presente lo usan metabólicamente.
• Anaerobios Aerotolerantes: Son anaerobios que pueden tolerar la presencia de O₂, pero son incapaces de usarlo metabólicamente.

2. El Agar Chocolate

El agar chocolate es un medio de cultivo enriquecido que se obtiene al calentar el agar sangre, lo que lisa los glóbulos rojos (GR) y libera los factores de crecimiento X (hemina) y V (NAD) necesarios para bacterias exigentes. El color marrón se debe a esta lisis.

Su composición incluye peptonas, extracto de levadura, cloruro de sodio, agar y un 5-10% de sangre desfibrinada (generalmente de oveja o caballo). Tiene un pH cercano a 7,2. Es un medio no selectivo, muy nutritivo, usado para el aislamiento de bacterias fastidiosas que no crecen en medios comunes. Entre las principales bacterias que crecen están: Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis y Haemophilus influenzae. A diferencia del agar sangre, no permite observar hemólisis porque los eritrocitos están destruidos. Se utiliza en cultivos de muestras respiratorias, genitales o de LCR, donde se sospechan patógenos exigentes. Debe conservarse refrigerado (2–8 ºC) y protegido de la luz para evitar su deterioro.

3. Funcionamiento del Sistema BD BACTEC

El sistema BD BACTEC es un modelo avanzado que dispone de un sensor fluorimétrico de gases integrado en el vial del hemocultivo. Los fotodetectores presentes en cada una de las estaciones del instrumento miden el nivel de fluorescencia emitido por cada vial, que se corresponde con la cantidad de CO₂ liberado por los microorganismos. También dispone de un sistema para controlar el volumen de sangre inoculada.

4. Procedimiento de Preparación de Medios de Cultivo Deshidratados

Para preparar medios de cultivo deshidratados, se deben seguir los siguientes pasos:

1. Leer cuidadosamente las cantidades y el modo de preparación que indica el fabricante del medio de cultivo deshidratado.
2. Pesar la cantidad necesaria para preparar el volumen deseado (ej. 300 ml) del medio de cultivo deshidratado (caldo o agar).
3. Preparar la cantidad calculada del medio deshidratado. Disolver por agitación el medio en la mitad del volumen de agua destilada en un matraz de 500 ml, y una vez disuelto, completar el volumen con el resto del agua.
4. Medio Líquido (Caldo): Dispensar el medio adecuadamente disuelto en una cantidad de 10 ml en 24 tubos de ensayo dispuestos en una gradilla. Poner el tapón metálico sin presionar y colocar dentro del autoclave junto con la cinta de autoclavar.
5. Medio Sólido (Agar): Si el medio de cultivo contiene agar, se debe calentar en el agitador magnético calefactable hasta su completa disolución. Si el fabricante lo indica, deberá llevarse a ebullición durante 1 minuto para que el agar se mezcle adecuadamente con el resto de componentes del medio de cultivo.
6. Esterilización: Autoclavar durante 15 minutos a 121 ºC y 1 atmósfera de sobrepresión.

Etiquetas: cultivo bacteriano, medios de cultivo, Microbiología, quimiostato