06 Feb
1. Técnicas de tinción histoquímicas :
Definición: Aplicación de reacciones químicas y bioquímicas sobre tejidos histológicos con el fin de localizar y determinar ciertas sustancias. Los mecanismos de tinción se dividen en dos grupos: directos e indirectos. ● En las directas el colorante posee la capacidad de teñir la sustancia en estudio, ● En las indirectas, el colorante al entrar en contacto con su objetivo, reacciona químicamente con él, tiñéndolo
. 2. Tipos de tinciones histoquímicas 2.1 Tinciones histoquímica para hidratos de carbono. 1) PAS :
Más utilizada en muchos laboratorios. ● material PAS positivo se ve rojo o magenta ● Detecta polisacáridos simples (glucosa, celulosa) y complejos (mucoproteínas) ● Se usa para moco o sustancias mucinosas, membranas basales y muchos hongos (B) y parásitos. Observamos núcleos azules, glucógeno morado/magenta intenso y el material PAS positivo de color rosado.
2) Azul alcián
Técnica para detectar mucopolisacáridos ácidos. ● pH debe estar en torno a 2,4-2,6. Si se usa a pH inferior (0,5-1) solo se tiñen los mucopolisacáridos ácidos sulfatados) ● Los mucopolisacáridos ácidos se tiñen de azul.
3) Azul de toluidina
Sustancias con carácter metacromático de color rojo y el resto en azul.
-Azul de Perls
Detección de hierro en forma iónica, sales ferrosas y férricas y ligado a proteínas. Permite detectar hemosiderina. • Se observa el hierro en azul y los núcleos en rojo.
-Von Kossa:
Detección de sales de calcio tanto fisiológico (hueso o diente) como patológico (lesiones o calcificaciones) • Iones calcio o calcificaciones en negro y en rojo los núcleos celulares.-
Fontana-Masson:
Detección de melanina.
Técnicas para microorganismos:
Giemsa
: rutinaria, formada por azul de metileno como colorante básico y eosina como tinte ácido. • pH entre 6,4 y 6,9. • Permite ver núcleos y carácterísticas de la cromatina, se usa para identificar células cebadas o mastocitos, tinción de bacterias y parásitos. • Es muy útil para la detección de Helicobacter pylori, Rickettsias y protozoos. • citoplasma rosa, núcleos azules, los glóbulos rojos naranja, gránulos de los mastocitos de color púrpura, las bacterias y los parásitos azules.
-Ziehl- Neelsen:
Se emplean en la detección de micobacterias(tuberculosis y lepra) • Son bacilos ácido-alcohol resistentes. Se verán de color rojizo.-
Gram
: Diferenciación entre bacterias G+ (azul) y– (rojo)-
Plata metenamina y otras:
Para detección de hongos y Pneumocistis, que se ven de color negro.-
PAS
Hongos.
Técnica de tinción par determinación de enzima
•deben poseer siguientes propiedades:– Opaco a la luz blanca, luz uv o haz de electrones en m.E.– Luminiscencia, tanto fluorescencia como fosforescencia. – Incremento del índice refractario– Reflectividad.
Manejo de los tejidos
Casi todas las técnicas usan tejido congelado, porque la mayoría de enzimas se inactivan con formol. ● Congelar en hielo seco (CO2 ) a-80º o en isopentano en un congelador (-25º), en un microtubo (biopsias) o en bolsa de plástico (resecciones quirúrgicas) ● Es importante el espesor mínimo de sección en criostato, recomendable realizar cortes finos. ● En algunos casos es difícil conseguir una muestra de referencia comercial con actividad enzimática conocida.
Aplicacione
Aceticolinesterasa:
Más común. Diagnóstico enfermedad de Hirschsprung-
Fosfatasa alcalina
: Enzima importante en barrera hematoencefálica, mucosa duodenal y túbulo proximal del riñón; su déficit indica deterioro funcional grave. • El aumento de la actividad de la fosfatasa ácida lisosomal es un marcador precoz de lesiones isquémicas de los tejidos. • Clasificación de enfermedades musculares, miopatías y distrofias. • Reacciones más usadas: ATPasa a pH4,5-9,4; deshidrogenasa succínica,NADH fosforilasa y citocromo C oxidasa. –
Lecitinas
Proteínas unidas a oligosacáridos o carbohidratos de manera específica, pueden usarse como los anticuerpos en inmunohistoquímica para obtener una reacción colorimétrica.
TIPO TEST: 1. Se ven mejor las carácterísticas de la cromatina del núcleo con:
b. Giemsa.
2. Para congelar muestras se usa:
b.Isopentano 3. Para detectar hierro se utiliza la tinción de:
a. Pearls 4. Se usan más como técnicas de histoquímica enzimática para la clasificación de enfermedades musculares, miopatías y distrofias:
a. Fosfatasa alcalina 4. Se usan más como técnicas de histoquímica enzimática para la clasificación de enfermedades musculares, miopatías y distrofias:
a. Fosfatasa alcalina 5. Con la técnica de Giemsa el Helicobacter pylori se ve de color:
a. Azul 6. Para ver amiloide se emplea:
C. Rojo Congo 7. La mejor técnica para ver bacterias ácido-alcohol resistentes es:
c. Ziehl-Neelsen 8. El primer paso de las técnicas histoquímicas es:
b. Desparafinar e hidratar
9. En la técnica de PAS, la preparación debe mantenerse en reactivo de Schiff durante:
b. 15-30 minutos 10. Para realizar el diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung se utiliza:
a. Acetilcolinesterasa 11. Para la determinación de enzimas es falso que:.
B. Es importante que el espesor de sección en criostato sea grueso
Inmunohistoquímica permite localización de antígenos específicos en tejidos o células gracias a un reconocimiento antígeno-
Anticuerpo
Técnica imprescindible en AP ofrecen datos diagnósticos y permite localizarlos en las diferentes células. • Se basa en la elevada afinidad que posee un anticuerpo por su antígeno. • Es imprescindible conservar la estructura antigénica. Podría ocurrir que un Ac no detectase cierta estructura por degradación durante el procesado, generando un falso negativo. • La fijación es el paso más problemático y se recomienda fijar por criogenización. • Si no se dispone del equipamiento necesario, la acetona es la que mejor preserva la estructura antigénica. • Los nuevos anticuerpos comerciales soportan bastante bien los métodos tradicionales de fijación con formalina e inclusión en parafina.
Los Ac pueden ser:
• Policlonales:
Proceden de la activación de distintos clones de linfocitos B. Al proceder de diferentes células reaccionan con distintos epítopos en el mismo antígeno, con diferente afinidad y especificidad.– Ventajas:
Alta sensibilidad, menor susceptibilidad a las alteraciones del tejido durante el procesamiento.– Inconvenientes:
Especificidad variable, con posibilidad de que acontezcan reacciones cruzadas; problemas de reproducibilidad; disponibilidad limitada.
• Monoclonales:
Proceden de un clon individual de células plasmáticas. –
Ventajas
Mayor especificidad; mayor reproducibilidad; mayor disponibilidad que los anticuerpos policlonales; ausencia de reacciones cruzadas con otras proteínas.– Inconvenientes:
Menor sensibilidad, con mayor probabilidad de obtener un resultado falso negativo; menor estabilidad en las mismas condiciones que los anticuerpos policlonales.
1.2 Marcaje de anticuerpos • Reacción antígeno-anticuerpo útil permite visualizarla, puede llevarse a cabo marcando los Ac por medio de diferentes técnicas. • El tipo de marcador utilizado va a permitir clasificar las técnicas. • Reacción cruzada: Ocurre cuando un anticuerpo puede
reaccionar con diferentes antígenos o viceversa, cuando un antígeno es reconocido por varios anticuerpos.
2. Fundamentos de los métodos IHQ:
Directos e Indirectos. Proporciona información adicional al patólogo. Permite detectar dan información sobre la biología, el estado y el pronóstico de la enfermedad. • Directa:
Se marca el anticuerpo primario que va a reaccionar con el antígeno.– Técnica rápida pero poco sensible.– Deben marcarse tantos anticuerpos como antígenos se quieran detectar. • Indirecta:
Marcado de un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario. • Es más sensible que el anterior, puede no detectar pequeñas cantidades de antígeno
. 3. Clasificación de las técnicas según el marcador empleado • Inmunofluorescencia:
Emplea un colorante fluorescente para marcar el anticuerpo, fluorescencia se detecta al exponerlo a la luz uv emitida por el microscopio.– Directa
: Tiempos de incubación cortos, protocolos de tinción doble o triple más sencillos. Como inconvenientes encontramos que la señal es menor, es más cara y el protocolo menos flexible. – Indirecta
: Mayor sensibilidad, los anticuerpos suelen ser más baratos. • La principal limitación de la IF es el fenómeno denominado fotobleaching, que consiste en una degradación irreversible del fluorocromo excitado por acción del oxígeno. Se controla utilizando la iluminación más baja posible dentro del intervalo de excitación del fluorocromo. • Inmunoenzimática:
Emplea enzima para marcar el anticuerpo. La reacción Ag-Ac se visualiza añadiendo, al final de la reacción, una sustancia denominada cromógeno. Al actuar la enzima sobre el anticuerpo interacciona con el cromógeno, dando lugar a un precipitado insoluble y coloreado. • Oro coloidal:
Emplea como marcador de inmunoglobulinas. Las limitaciones se controlan usando iones de plata.
4. Procesamiento histológico y restablecimiento de la inmunorreactividad tisular• Decalcificación
: cambiar la inmunorreactividad e incluso hacer que desaparezca al cabo de pocas horas de tratamiento. • Inclusión
: Durante la deshidratación y la aclaración, algunas sustancias pueden interferir en la inmunorreacción. • Acetona o cloroformo en lugar de etanol mejoran la inmunotinción y reducen la tinción de fondo. • La inclusión en parafina da mayor tinción de fondo.
4. 1 Técnicas de recuperación antigénica fijadores crean enlaces que enmascaran los epítopos de los antígenos, por lo que impiden que el anticuerpo pueda unirse a ellos. • La recuperación antigénica permite revelar los epítopos rompiendo los enlaces creados y quedando así disponibles para su uníón con el anticuerpo. • 2 métodos principales-
Digestión enzimática
Empleo de enzimas proteolíticas que rompen los enlaces y ponen de manifiesto los epítopos. • Inconvenientes:
Solo se beneficia un número reducido de anticuerpos; estabilización difícil; si es excesiva puede destruir los tejidos o enmascarar fragmentos proteicos comunes a varios antígenos incrementando la tinción inespecífica. –
Inducción por calor:
Más usado. Distintos métodos: microondas, olla a presión, autoclave.
4. 2 Bloqueo de la actividad enzimática endógena
Si empleamos enzima que de forma natural presente en el tejido a examinar, debemos inhibir actividad endógena antes de la inmunotinción, para reducir falsos positivos. • Entre los métodos empleados destacan:-
Incubación en metanol absoluto con peróxido de hidrógeno:
para el bloqueo de la actividad endógena de las peroxidasas.-
Levamisol
Bloqueo de la fosfatasa alcalina, excepto la de tipo intestinal.
4. 3 Bloqueo de la tinción de fondo
Engloba toda tinción inespecífica de una preparación inmunohistoquímica. Puede ocurrir de forma directa por presencia del antígeno en lugares diferentes al que se quiere detectar. O deforma indirecta por uníón no inmune de un antisuero a los componentes de los tejidos. • Puede reducirse bloqueando los lugares con afinidad no inmune por las Ig añadiendo suero bloqueante al antisuero primario
. 4. 4 Controles • Control negativo:
Tejido que carece de un determinado anticuerpo y no debe dar positivo a una tinción IHQ.
• Control positivo:
Empleo de una sección de tejido en la que se sabe que se encuentra el antígeno que se quiere detectar. • Si el resultado es negativo en la preparación a estudiar se debe a fallos técnicos.
4. 5 Tipos de anticuerpos y diluciones
• Anticuerpo primario:
Reactivo responsable de dar especificidad a la reacción IHQ de forma concentrada o diluida. Es una molécula que de manera natural no está marcada • Soluciones de anticuerpos policlonales, contienen muchos clones de Ac con diferentes especificidades por los diferentes Ag, pero suele enriquecer los anticuerpos de más afinidad y eliminar selectivamente los de baja afinidad.
• Dilución óptima de un mismo Ac diferente entre laboratorios, entendiendo que se trata de la concentración que proporciona la intensidad-especificidad más alta con la mínima tinción de fondo inespecífica. • Diluyentes de anticuerpos son soluciones tamponadas. • Estas soluciones aportan estabilidad a la dilución del Ac y favorecen su optimización. • El tampón más empleado es el PBS.
• En el caso de los reactivos comerciales tener en cuenta que vienen prediluidos y probados por el fabricante. 5.1 Peroxidasa
Enzima que se utiliza para marcar anticuerpos. • La técnica puede ser:-
Con Ac marcados:
La enzima se una directamente al anticuerpo mediante enlace covalente. Asu vez puede ser directa o indirecta.-
Con Ac no marcados:
Técnica de la peroxidasa-antiperoxidasa que se puede usar con ac policlonales o monoclonales. • Ventajas:
Alta sensibilidad • Inconvenientes:
Aparición de falsos positivos por la preexistencia de peroxidasa en los tejidos.
5.2 Fosfatasa alcalina • Inconveniente:
Medio de montaje acuoso. • Ventaja:
Enzima no se encuentra en muchos tejidos del organismo al contrario que la peroxidasa.
TIPO TEST:
1. Marca la opción falsa entre las siguientes:
b. Las inmunoglobulinas constan de dos cadenas pesadas idénticas y tres cadenas ligeras.
2. ¿Cuál de las siguientes es una ventaja del método de marcaje de anticuerpos directo?
c. Es una técnica rápida 3. Principal limitación de la inmunofluorescencia:
C. Fotobleaching 4. Enzima que se utiliza con mayor frecuencia en el marcaje de anticuerpos:
d. Peroxidasa 5. Principales técnicas de recuperación antigénica:
c. Inducción por calor y digestión enzimática 6. ¿Cuál de las siguientes sustancias permite bloquear la actividad endógena de la peroxidasa?
b. Metanol con peróxido de hidrógeno 7. Marca la respuesta correcta sobre los controles en inmunohistoquímica:
c. Para el control negativo se emplean tejidos de los que se sabe que no disponen del antígeno problema 8. Principal inconveniente de las técnicas basadas en la peroxidasa:
c. Presencia de peroxidasa endógena 9. ¿Cuál de los siguientes paneles inmunohistoquímicos se deberían utilizar ante la sospecha de un adenocarcinoma de pulmón?
b. CK7, TTF1, BerEP4 10. Marca la afirmación correctad. Todas las anteriores son correctas.
TEMA 7: Procesado general del material citológico • no exfoliativas muestras líquidas contienen células en suspensión procedentes de la descamación natural (Orina) • exfoliativas proceden del raspado de un epitelio mediante instrumental sencillo y se extienden rápidamente sobre un portaobjetos • Las muestras citológicas forzadas se obtienen usando material complejo que permite recoger muestras del interior de las cavidades corporales.
1 Citología exfoliativa corporal
Muestras extraídas de forma no invasiva. • Obtención mediante cepillos, torundas u otros dispositivos que obtengan células descamadas naturalmente– Citología cérvico-vaginal, vaginal, vulvar, endometrial.– Cepillado mucosa bronquial, mucosa oral.– Secreciones naturales: pezón, orificios naturales y no naturales– Material obtenido mediante PAAF. • Las muestras superficiales usando vista y tacto, las de PAAF de órganos profundos se hacen ecoguiadas por personal experimentado. • Las muestras se reciben en el laboratorio extendidas sobre portaobjetos que pueden haberse secado al aire, conservado con citospray o sumergido en alcohol de 96%.
1. 2 Líquidos corporales y orinas
Líquido pleural, peritoneal o ascítico, pericárdico, LCR, sinovial y orina. Para estudiar se centrifugan, en función del tipo de muestra se elegirá la centrífuga y el programa más adecuado. Las más utilizadas: • Centrífuga de decantación:
Para concentrar células de muestras líquidas con grandes volúMenes mediante fuerza centrífuga y separarlas del medio líquido. Si se obtiene material denso y rico en células se realizará un citobloque. Si el material obtenido es líquido, se extrae, se diluye en 1 ml de PBS y se centrifuga en un Cytospin. • Citocentrífuga:
Para aglutinar células de un líquido, con un volumen <2ml, sobre un portaobjetos. • Citología en medio líquido:
Mayor calidad. Absorción de muestra a través de un filtro que retiene las células hasta que se satura y las deposita sobre un portaobjetos. Es más caro. Se puede emplear para cualquier tipo de líquido. El portaobjetos obtenido después de llevar a cabo una centrifugación, deberá fijarse antes de proceder a la tinción; se sumerge en alcohol 96º durante al menos 15 minutos. Debe tenerse en cuenta la velocidad y el tiempo de centrifugación demasiado elevados pueden producir la lisis celular. 1.3 Vías respiratorias . • Esputo: obtenido por expectoración espontánea o inducida del paciente. Se recibe en fresco, extenderla sobre un portaobjetos ayudándonos
de otro y dejarla lo más fina posible. -Fijar con alcohol de 96º durante 15 minutos y teñir. Siempre bajo campana ya que pueden contener patógenos de transmisión aérea • Lavado broncoalveolar:
Inyección de suero salino para lavar un segmento pulmonar, luego se recoge mediante aspiración. Menos denso que el esputo.-Procesar con centrífuga de decantación, desechar sobrenadante y diluir con 1 ml de PBS.-Centrifugar la dilución en Cytospin a 500rpm durante 10 minutos.-Sumergir el portaobjetos con material adherido, en alcohol 96º durante 15 minutos, antes de realizar la tinción. • Aspirado broncoalveolar:
Aspirado de material del árbol bronquial. Material espeso y denso. 2. Fundamentos, reactivos y protocolos de las técnicas de tinción.
3 pasos sucesivos: Extensión, fijación y tinción. • Fijadores más usados son Alcohol de 96º, citospray, líquido de Carnoy • Las técnicas de tinción más utilizadas son: Papanicolaou, Diff-Quick y May-GrünwaldGiemsa. 2.1 Tinción de Papanicolaou en 1925. Método más usado en citología exfoliativa, y en citología ginecológica. • Utiliza los siguientes colorantes:– Hematoxilina de Harris:
Colorante nuclear. Tiñe el núcleo de las células de color azul oscuro.– Orange G:
Tiñe de color naranja los citoplasmas de las células que contienen queratina.– EA-50:
Recibe ese nombre por tener cantidades variables de otros compuestos (EA-36, EA-65) como verde luz o pardo Bismark. 2.2 Tinción Diff-Quick sobre extensiones secadas al aire. Combinación de dos coloraciones sucesivas. • Resalta detalles celulares y componentes de fondo como colágeno, mucina o coloide. • Usan 2 colorantes comerciales, colorante I (Naranja) y colorante II (azul) Núcleo azul violáceo, citoplasma de azul claro a rosa, neutrófilos rosa, eosinófilos marrón rojizo…- Esta técnica permite aplicar posteriormente la de papanicolaou sin necesidad de decolorar.-Si la coloración no fuera correcta se reinicia el proceso después del lavado. 2.3 Tinción de May-Grünwald-Giemsa sobre material secado al aire. • Combinación de 2 coloraciones sucesivas, la de MayGrünwald y la de Giemsa. • Ventajas sobre papanicolaou y hematoxilina-eosina para la percepción de los finos detalles sobre el diagnóstico de malignidad. • Resalta detalles del citoplasma como: la presencia de vacuolas, gránulos o mucina. 2.4 Tinción de Hematoxilina-Eosina • Hematoxilina: Varios tipos, Harris
(más usada si la muestra se seca al aire) y la de Carazzi (si se fija en alcohol 96%) Colorea los núcleos de azul oscuro. • Eosina: Colorante de contraste, da al citoplasma tonosrosáceos o anaranjados. 2.5 Técnicas citoquímicas Además de las técnicas rutinarias podemos complementar con otras para las distintas patologías: PAS, plata metenamina, ZiehlNeelsen, etc. Procedimiento igual que en histología pero sin necesidad de desparafinar e hidratar la muestra. 3. Bloques celulares. Concepto, fundamento y preparación.
son acumulaciones celulares que finalizan su proceso como si fueran una biopsia. • Coágulo: (moco, sangre…) La mejor manera de estudiarlos es preparando un citobloque.-Se envuelve el coágulo en papel de arroz, se introduce en un cassette y se inicia el proceso como en una biopsia. • Microtubo: Muestras muy densas o muy celulares; como no forman un grupo cohesionado como en el caso anterior se realiza lo siguiente:– Centrífuga de decantación 10 min Citogel: Similar al anterior.- Centrífuga de decantación 10 min a 2000rpm-Decantar y añadir 10 ml de etanol. TIPO TEST: 1)PAAF → Punción Aspiración con Aguja Fina. 2) BAS → Broncoaspirado. 3)BAL → Lavado Broncoalveolar. 4. ¿Cuánto tiempo ha de estar la muestra en fijador antes de empezar la tinción?
15 min mínimo
Entre 12 y 24 horas 5. ¿En qué sustancia se fijan las muestras?
alcohol, 6. ¿Con qué máquina iniciarías el proceso de una muestra líquida de 470 ml?
de tipo cytospin. 7. ¿Cuáles y en qué orden se usan los colorantes para Papanicolaou?
Hematoxilina, Orange G (OG-6), EA. 8. ¿Cuánto tiempo de tinción requiere el EA-50?
5 minutos. 9. ¿Cuál es el paso previo a la tinción de Diff-Quick?
secar al aire 10. ¿Cuánto tiempo puede permanecer una muestra a temperatura ambiente antes de ser procesada?
hasta 12h. 11. ¿Cuál es el periodo máximo que se puede conservar una muestra utilizable para estudio?
72h.Hasta 2 semanas 12. ¿Con qué procedimiento conservaremos una muestra citológica líquida para que siga siendo utilizable el máximo periodo de tiempo posible?
diluir 50%. 13. ¿Cuál es el programa que utilizaremos en la centrífuga de decantación para hacer un citobloque?
10 min a 2000 rpm
Deja un comentario