Fotometría de Reflectancia o Química Seca

1. Introducción

El término de química seca se refiere a la presentación de los reactivos que se encuentran embebidos en una matriz en estado seco y no precisa rehidratación antes de su utilización. Los reactivos se sumergen directamente en la muestra objeto de estudio y esta actúa como solvente (rehidrata los reactivos y permite la reacción).

El empleo de tiras de papel impregnadas de reactivos es antiguo; por ejemplo, la medición del pH con el papel de tornasol. Los sistemas de reactivos en química seca comprenden:

• Los sistemas de tiras reactivas: Están formados por unas tiras de plástico que sirven de soporte a los reactivos que se encuentran en el interior de una matriz (celulosa).
• Sistemas de películas multicapa: Presentan los reactivos como finas láminas superpuestas.

La lectura de resultados puede ser:

• Visual: Cualitativa o semicuantitativa.
• Fotometría de reflexión: Cuantitativa.

La química seca se utiliza para facilitar el diagnóstico rápido en UCIs, quirófanos, paritorios, también en screening de orinas, en el control de diabetes, etc.

Ventajas e Inconvenientes

Las ventajas que presenta son:

• Facilidad de uso: Basta aplicar la muestra al reactivo en fase sólida para obtener en unos minutos el resultado (ej. control de glucemia en diabéticos).
• No es necesaria la preparación previa de los reactivos (son reactivos unidad), con lo cual disminuimos manipulaciones que pueden producir errores en el resultado.
• Los reactivos son estables mucho tiempo y su almacenamiento es fácil, al contrario de lo que sucede con las técnicas colorimétricas en las que el tiempo de estabilidad del reactivo una vez reconstituido suele ser corta.

El inconveniente es su elevado precio frente a la espectrofotometría de absorción.

2. Fundamento

Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, este es reflejado originando dos tipos de reflexión:

• Una reflexión especular, que consiste en que el haz de luz es reflejado con un ángulo de reflexión igual al de incidencia (como por un espejo).
• Una reflexión difusa o reflectancia, debida a fenómenos de absorción y dispersión producidos por los distintos componentes de las capas que atraviesa el haz de luz.

Obtenemos un haz de luz que sale de la fase sólida con una intensidad que podemos medir. La relación entre la intensidad de luz reflejada y la intensidad de luz incidente se denomina reflectancia (R).

R = Ir / Io

• R = Reflectancia
• Ir = Intensidad de luz reflejada
• Io = Intensidad de luz incidente

La reflectancia la podemos expresar como porcentaje de reflectancia (%R): % R = (Ir / Io) * 100.

Estas ecuaciones son similares a las que estudiamos en la transmitancia y, como en aquel caso, no guardan una relación lineal respecto a la concentración. Para facilitar los cálculos, es necesario linealizar esta relación, es decir, conseguir una relación lineal entre la concentración y la medida de reflectancia.

Para establecer una relación lineal entre ambos parámetros, concentración y reflectancia, se recurre a las ecuaciones de Kubelka-Munk y la de Williams-Clapper. El empleo de una u otra ecuación depende de la iluminación, características de reflectancia del reactivo seco y la disposición de los elementos en el instrumento de medida.

3. Espectrofotómetros de Reflectancia

La medida de la reflectancia producida después de la incidencia de luz sobre la muestra situada en el reactivo en fase sólida se realiza, bien mediante la comparación visual del color obtenido con una escala de colores o mediante la utilización de un sofisticado equipo: los espectrofotómetros de reflectancia.

Los espectrofotómetros de reflectancia miden la reflectancia y la relacionan con la concentración de la sustancia. El funcionamiento de los espectrofotómetros de reflectancia es similar a los espectrofotómetros de absorción, pero su diseño es más complejo.

Componentes del Espectrofotómetro

Presentan los siguientes componentes:

• Fuente de luz
• Sistemas ópticos
• Reactivos en fase sólida: Tiras reactivas o películas multicapa («slides»).
• Detector y sistemas de lectura

Fuente de luz

Se emplean fundamentalmente dos tipos de lámparas:

• Lámparas de espectro continuo de haluro de tungsteno.
• Lámparas de espectro discontinuo como el arco de xenón o un LED (diodos emisores de luz).

Sistemas ópticos

Consisten en combinaciones de lentes, espejos y filtros o sistemas integrados en forma de esfera cuyo fin es dirigir el haz de luz reflejada al detector para su lectura.

Reactivos en fase sólida

La muestra se sitúa en los reactivos de fase sólida, bien tiras reactivas o reactivos multicapa («SLIDES»). Todos los componentes necesarios para que se produzca la reacción están impregnados en ellos, y es donde tiene lugar la reacción y la lectura.

La muestra, que contiene el analito a determinar, se aplica sobre la superficie del reactivo en fase sólida y, a partir de esta, difunde a la matriz disolviendo los componentes que contiene y produciéndose la reacción. Los componentes básicos son tres:

• Parte soporte: Lámina de material plástico que sirve de soporte y recubierta de materiales reflectantes que la convierten en capa reflectora.
• Parte reflectante: Compuesta por materiales como óxido de titanio, sulfato bárico, óxido de magnesio y óxido de zinc. Su función es reflejar la luz y su característica principal es que la absorbancia de luz a la longitud de onda de trabajo sea nula para asegurar máxima sensibilidad.
• Parte reactiva: Contiene en forma deshidratada los reactivos y sustancias auxiliares para que se produzca la reacción.

Opcionalmente se pueden añadir otras partes complementarias como:

• Capa difusora: Su función es hacer que la muestra difunda rápidamente hacia los laterales tras su aplicación, consiguiéndose así una distribución uniforme del volumen de muestra.
• Capa separadora de plasma: En los sistemas para analizar sangre total, su función es retener las células y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo (suele ser de fibra de vidrio).

Tiras reactivas

Consisten básicamente en una lámina de plástico blanca rígida que sirve de soporte a una matriz constituida por fibras como la celulosa impregnada con los reactivos. Si la tira está diseñada para determinar distintos componentes de la muestra, a cada analito le corresponde una zona reactiva diferente. La lectura del resultado se realiza sobre la superficie sobre la que se deposita la muestra.

Películas multicapa o «slides»

Constituidas por diferentes capas, muy finas, a través de las cuales se van produciendo de forma secuencial todas las etapas que llevan a la determinación cuantitativa del analito. Tienen la apariencia de una diapositiva y están constituidas por cuatro capas de naturaleza gelatinosa enmarcadas en un soporte de poliéster. El sistema de más amplia implantación es el Ektachem de Kodak.

Detector y sistemas de lectura

La lectura de la reflectancia se puede hacer básicamente por dos procedimientos:

• Lectura sobre la superficie: La muestra se aplica sobre la superficie, difunde y se produce la reacción; el color resultante se mide sobre la superficie. Se emplea en las tiras reactivas.
• Lectura por el reverso de la superficie: La reflectancia se mide sobre el lado opuesto a la superficie de aplicación. Se emplea en los sistemas multicapas o slides.

4. Aspectos Prácticos

Los dos sistemas utilizados tienen dos enfoques claramente definidos:

• Las tiras reactivas (Seralyzer de Ames y Reflotron de Boehringer) van dirigidas a laboratorios con poca carga de trabajo, su manejo y mantenimiento es muy sencillo.
• Los sistemas multicapa Ektachem de Kodak se utilizan en laboratorios de gran volumen de muestras, ya que son la base de grandes autoanalizadores.
• Son muy importantes los reflectómetros para el autocontrol de los diabéticos; los que se usan actualmente son slides potenciométricos.

Nefelometría y Turbidimetría

1. Fundamento

Cuando un haz de luz atraviesa una suspensión, parte de la luz es absorbida por las partículas, parte es reflejada, parte es dispersada y parte es transmitida: Io = Ia + Ir + Id + It.

La nefelometría y la turbidimetría son técnicas relacionadas con la espectroscopia de absorción molecular en el espectro de la luz visible. En ellas se mide la radiación dispersada (nefelometría) o la radiación transmitida (turbidimetría) por la muestra que contiene partículas no transparentes en suspensión.

• La turbidimetría mide de forma indirecta la radiación bloqueada por las partículas, relacionando la intensidad de la luz incidente y la intensidad de la luz transmitida.
• La nefelometría mide la radiación dispersada por las partículas; por tanto, el detector se sitúa en ángulos distintos al de la luz incidente.

La cantidad de luz dispersada depende de varios factores:

• Concentración de partículas (analito).
• Volumen, tamaño, peso y número de partículas.
• Longitud de onda de la radiación incidente.
• Distancia del detector a la cubeta.

Ley de Rayleigh y Modelos de Dispersión

La forma en que la luz es dispersada depende de la relación entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda (λ) de la luz incidente:

• Tamaño de partícula menor que la λ incidente: La intensidad máxima corresponde a la luz dispersada a 180º y 0º (hacia delante y atrás).
• Tamaño de partícula ligeramente inferior a la λ incidente: Es mucho mayor la luz que se dispersa hacia delante que hacia atrás y no existe simetría.
• Tamaño de partícula superior a la λ incidente: La intensidad máxima corresponde al ángulo de 0º. No existe dispersión a 90º y 270º.

La intensidad de la luz dispersada es:

• Inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda (a menor λ, mayor sensibilidad).
• Directamente proporcional al peso molecular de las partículas y a su concentración.
• Inversamente proporcional al cuadrado de la distancia del detector.

Turbidimetría vs. Nefelometría

La turbidimetría mide la disminución de la intensidad de un haz incidente (luz transmitida) a 0º. Se puede medir como %T o como absorbancia en cualquier espectrofotómetro. Se cumple la ley de Lambert-Beer, aunque en la práctica se requiere una recta de calibración.

La nefelometría es la medida de la luz dispersada en ángulos distintos al de la radiación incidente, generalmente entre 15 y 90º. Se realiza en aparatos diseñados al efecto: los nefelómetros.

2. Instrumentación

1. Fuente de luz: Lámparas de cuarzo, halógenas, xenón, tungsteno y láser helio-neón. El láser ofrece gran intensidad y no necesita colimador.
2. Colimador-Rendija de entrada: Corrige la trayectoria de los haces para que incidan de manera paralela.
3. Selector de longitud de onda: Filtros o monocromadores.
4. Cubeta: Similares a las de espectrofotometría.
5. Sistema de detección: Tubos fotomultiplicadores fijos o móviles. La sensibilidad máxima se alcanza en posición 0º.
6. Lector: Convierte la fracción de luz dispersada en corriente eléctrica (unidades arbitrarias o concentración).

Sensibilidad e Interferencias

• En nefelómetros, la sensibilidad depende de la lectura del blanco. A menor lectura del blanco, mayor sensibilidad.
• En turbidímetros, depende de la capacidad de detectar pequeñas variaciones en la absorción.
• Interferencias: Partículas del reactivo o del suero (lipoproteínas y quilomicrones en sueros lipémicos). Se evitan mediante técnicas cinéticas y limpieza rigurosa.

Longitud de Onda y Tipos de Análisis

Debido a la absorción de proteínas y cromógenos, se trabaja con longitudes de onda entre 320-380 nm y 500-600 nm. Existen dos tipos de medición:

• Análisis a punto final: Requiere blanco y tiempo de espera.
• Análisis de velocidad o cinético: Estudia el cambio de velocidad de la reacción y no requiere blanco.

Uso de coloides protectores: Se aconseja el uso de sustancias como el polietilenglicol (PEG) para aumentar la estabilidad de la suspensión y asegurar la reproducibilidad.

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