Significado Fisiológico de los Parámetros de Michaelis-Menten

Este apartado explora el significado de los parámetros Vmax, Km y k2 de la ecuación de Michaelis-Menten, considerando la hipótesis de estado pseudo-estacionario de Briggs y Haldane.

Cinética Enzimática sin Hipótesis de Estado Pseudo-Estacionario

En ausencia de la hipótesis de estado pseudo-estacionario, el valor de Km corresponde al inverso de la constante de equilibrio de formación del complejo enzima-sustrato (ES). Es decir, Km = k-1/k1 = 1/Keq. Representa la concentración de sustrato (Cs) a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.

Cinética Enzimática con Hipótesis de Estado Pseudo-Estacionario

Bajo la hipótesis de estado pseudo-estacionario, se mantiene el mismo modelo cinético, pero el sentido físico de Km cambia. En este caso, el valor de Km corresponde al cociente entre las constantes cinéticas de descomposición (k-1 + k2) y de formación (k1) del complejo ES (Km = (k-1 + k2) / k1).

Significado de Vmax y k2

El valor de Vmax (velocidad máxima), por otro lado, corresponde a la constante catalítica (k2), también conocida como número de recambio, multiplicada por la concentración inicial de enzima (Vmax = k2 * [E]0). Es el valor máximo de velocidad que puede adquirir una reacción enzimática cuando la enzima está saturada de sustrato. El valor de k2 es la constante de velocidad de formación de producto (E+P) a partir de la descomposición del complejo ES.

Reactores Biológicos: Fed-Batch y Cinética de Monod

Variación de Variables en un Reactor Fed-Batch de Dos Etapas

En un reactor Fed-Batch, la alimentación se realiza en cargas sucesivas y no se retira producto, lo que provoca un aumento del volumen a lo largo de la reacción. Este tipo de reactor permite controlar la concentración de sustrato y/o nutrientes en el medio de cultivo, facilitando el trabajo con concentraciones elevadas de sustrato y aumentando la productividad global. Es una estrategia idónea cuando el producto inhibe la reacción, ya que permite mantener las concentraciones en niveles óptimos.

Con esta configuración se logra que:

• El sustrato se mantenga siempre por encima de un nivel que asegura una velocidad de consumo adecuada.
• La concentración de producto se mantenga siempre por debajo del umbral de inhibición.
• Se controle la concentración de microorganismos.

Inhibición Enzimática

Inhibición Competitiva por Sustancia Extraña vs. Inhibición por Sustrato

La inhibición competitiva se produce por la presencia de una sustancia (inhibidor) que posee una estructura similar al sustrato y compite con este por el mismo sitio activo de la enzima. De esta manera, queda menos enzima libre disponible para reaccionar con el sustrato de interés, lo que disminuye la velocidad de reacción.

Se diferencia de la inhibición por sustrato en que la inhibición competitiva implica una sustancia que no es ni sustrato (S) ni producto (P), y afecta la formación del complejo enzima-inhibidor (E+I). En cambio, la inhibición por sustrato ocurre cuando el propio sustrato, a altas concentraciones, se une a un segundo sitio en el complejo enzima-sustrato (ES), formando un complejo inactivo (ESS) y reduciendo la velocidad de reacción.

Ventajas de la Recirculación de Microorganismos en un Reactor Continuo de Tanque Agitado (CSTR)

La recirculación de microorganismos en un CSTR ofrece múltiples beneficios:

• Mejora de la Eficiencia: Al recircular los microorganismos, se crea un ambiente favorable para su crecimiento y actividad metabólica, maximizando la eficiencia del proceso biológico al mantener una población activa y saludable en el reactor.
• Control de la Concentración Celular: Permite controlar y mantener la concentración celular dentro del reactor. Esto es crucial en procesos que requieren una alta densidad de biomasa para mayor productividad, ya que se parte de una mayor cantidad de organismos, evitando el consumo de sustrato adicional para el crecimiento inicial de una población pequeña. Una concentración celular adecuada también es vital para mantener una alta tasa de reacción y prevenir la pérdida de actividad biológica.
• Reducción del Tiempo de Retardo: Los organismos ya se encuentran aclimatados, lo que evita el tiempo de retardo inicial.
• Adaptabilidad a Cambios en la Alimentación: Facilita la adaptación del sistema a variaciones en la composición o concentración del sustrato alimentado. La recirculación permite un tiempo de adaptación más rápido para los microorganismos, manteniendo una población activa y estable incluso durante los cambios. Esto elimina la necesidad de añadir microorganismos constantemente, permitiendo una reacción continua sin pausas.

Modelos de Flujo en Reactores Biológicos

Modelo de Flujo de Mezcla Perfecta (CSTR)

En un fermentador continuo (quimiostato) con mezcla perfecta, la composición de la corriente de salida es idéntica a la composición en cualquier punto dentro del reactor. Esta composición no varía con el tiempo, por lo que se considera que el sistema está en estado estacionario. Hay una mezcla perfecta en todos los puntos del reactor.

En un fermentador discontinuo (batch), la composición dentro del reactor sí varía con el tiempo, aunque, al ser de mezcla perfecta, es la misma en todos los puntos del reactor en un instante dado. No hay corrientes de entrada ni salida. En este tipo de reactor, el producto y los microorganismos aumentan a lo largo de la reacción, mientras que el sustrato disminuye.

Modelo de Flujo en Pistón (PFR)

Los reactores de flujo en pistón son reactores tubulares que se caracterizan por la ausencia de retromezclado (backmixing). Cada porción de la corriente de entrada que ingresa no se mezcla en absoluto con la porción inmediatamente posterior. La composición de cada diferencial de volumen varía a lo largo de la longitud del reactor.

En un reactor de flujo en pistón, la concentración de producto y microorganismos aumenta progresivamente a lo largo del reactor, mientras que la concentración de sustrato disminuye.

Fases del Crecimiento de una Población de Microorganismos

El crecimiento de una población microbiana en un cultivo por lotes (batch) sigue típicamente varias fases:

1. Fase de Retardo (Lag Phase): Inicialmente, se produce un proceso de adaptación celular en el que no hay crecimiento. Este período es más largo cuanto más dispares son las nuevas condiciones de crecimiento respecto a las originales.
2. Fase de Aceleración: Una vez terminado el período de retardo, se produce una aceleración gradual hasta que se inicia un crecimiento exponencial del número de células.
3. Fase Exponencial (Log Phase): Durante esta etapa, hay un exceso de sustrato y componentes esenciales, lo que permite a los microorganismos crecer sin limitaciones. Aún no se han producido sustancias inhibitorias o antibióticos que puedan afectar este crecimiento.
4. Fase de Deceleración: Al finalizar la fase exponencial, a medida que el sustrato se agota y se acumulan productos inhibidores, se produce una desaceleración del crecimiento hasta alcanzar la fase estacionaria.
5. Fase Estacionaria: Se llega a una situación de crecimiento nulo debido al agotamiento del sustrato, de algún otro componente necesario para el crecimiento, o a la acumulación de productos tóxicos para las células. Si la fase estacionaria se debe a la acumulación de una toxina, la dilución (como en un reactor Fed-Batch) podría permitir un crecimiento posterior.
6. Fase de Muerte: Una vez finalizada la fase estacionaria, se produce la fase de muerte de las células. Esta fase no suele ser de interés en procesos industriales, que se diseñan para operar lejos de estas condiciones.

Crecimiento Celular con Inhibición por el Producto

Parámetros de la Ecuación Cinética

En el crecimiento celular con inhibición por el producto (P), la ecuación cinética más común incluye los siguientes parámetros:

• Cp*: Es la máxima concentración de producto P que provoca el cese del crecimiento celular.
• n: Es un parámetro empírico a ajustar, que describe la sensibilidad del crecimiento a la inhibición por el producto.
• μmax: Corresponde a la velocidad específica de crecimiento máxima (tasa de crecimiento específica máxima) que la población puede alcanzar en condiciones óptimas.
• Km: Es un parámetro del sistema análogo a la constante de Michaelis, aunque en este contexto cinético de crecimiento microbiano, no siempre tiene un significado físico directo como una constante de afinidad.

Configuración de Reactores en Serie

Condiciones Idóneas para un Fermentador de Tanque Agitado y uno Tubular en Serie

Es idóneo utilizar un fermentador de tanque agitado (CSTR) y uno tubular (PFR) conectados en serie en condiciones donde el uso de un solo reactor, o de varios reactores del mismo tipo, implicaría la necesidad de un volumen total mayor para alcanzar la conversión deseada. Esta configuración combinada (CSTR + PFR) a menudo permite optimizar el volumen total del reactor para cinéticas de reacción específicas, buscando siempre el menor volumen posible para una eficiencia óptima del proceso.

Esterilización en Bioprocesos

Criterio de Esterilización: Alcance y Objetivos

El criterio de esterilización es una forma de cuantificar y establecer el nivel de eliminación de microorganismos no deseados presentes en el fermentador y el medio de cultivo. Es importante destacar que la esterilización absoluta (es decir, alcanzar una población de microorganismos de cero, n=0) requeriría un tiempo de exposición infinito. Por lo tanto, en la práctica, se trabaja con un tiempo de esterilización que asegure una probabilidad extremadamente baja (X) de que sobreviva un microorganismo contaminante.

Proceso de Esterilización en Medio Líquido Discontinuo

Una operación de esterilización en discontinuo (por lotes o ciclo) consta de tres etapas secuenciales:

1. Calentamiento: El líquido se calienta desde la temperatura inicial (T0) hasta la temperatura de esterilización (Test).
2. Fase de Temperatura Estacionaria: La temperatura de esterilización (Test) se mantiene constante durante un tiempo determinado para asegurar la inactivación microbiana.
3. Enfriamiento: El medio se enfría desde la temperatura de esterilización hasta la temperatura de trabajo (Treac), momento en el que se procede a la inoculación de la cepa deseada.

Necesidad de Esterilización en Reactores con Microorganismos

La esterilización es fundamental en los reactores que emplean microorganismos porque garantiza la presencia exclusiva de las colonias de nuestro inóculo durante la fermentación. Si se omite este paso, se produciría un cultivo mixto, lo que impediría que el reactor funcionara en las condiciones óptimas requeridas. Un cultivo mixto daría lugar a procesos de competición por los nutrientes, posible producción de sustancias bactericidas como productos secundarios (dependiendo de la cepa contaminante), y una reducción general de la productividad y eficiencia del bioproceso.

Métodos de Esterilización

Existen diversos métodos para lograr la esterilización en bioprocesos:

• Calor: Es el método más común y efectivo para sólidos y líquidos. Implica la inyección de vapor de agua o el calentamiento directo del medio.
• Agentes Químicos: No se usan comúnmente en medios líquidos, ya que pueden contaminar el medio de cultivo. Se utilizan principalmente para desinfectar superficies o equipos.
• Rayos UV: Rompen el ADN de los microorganismos, inactivándolos. Tienen poca penetración, por lo que se utilizan para esterilizar superficies en entornos como hospitales o cabinas de flujo laminar.
• Métodos Mecánicos: Incluyen los ultrasonidos, que pueden destruir células por cavitación, y la filtración, que se usa para retener y eliminar microorganismos del aire o de líquidos sensibles al calor.

Esterilización Continua

La esterilización continua ofrece varias ventajas sobre la esterilización por lotes:

• Simplificación de la Planificación: Permite una planificación de la producción más sencilla, maximiza el uso de la planta y minimiza las interrupciones.
• Condiciones Reproducibles: Opera en condiciones más estables y reproducibles.
• Mayor Temperatura y Menor Tiempo: Permite operar a mayores temperaturas, lo que resulta en tiempos de esterilización más cortos.
• Recuperación de Energía: Facilita la recuperación de energía del medio a esterilizar, lo que se traduce en un menor consumo de vapor de calefacción y agua de enfriamiento.

Dentro de la esterilización continua, se distinguen dos tipos principales de calentamiento:

• Inyección Directa: Es más efectiva, ya que la temperatura de esterilización se alcanza más rápidamente. El tiempo de calentamiento se reduce significativamente (y a menudo se ignora en los cálculos). El enfriamiento se realiza por evaporación súbita (flash evaporation) en un recipiente adiabático.
• Calentamiento Indirecto: Utiliza intercambiadores de calor, que son más eficientes por su área de intercambio y porque el caudal de líquido a esterilizar no es muy grande. Es el método preferible cuando los fluidos son viscosos.

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