Eficiencia, Seguridad y Gestión de Residuos

Eficiencia

Eficiencia: Relación entre los recursos utilizados en un proyecto y los logros conseguidos con el mismo.

Seguridad y Prevención de Riesgos en el Laboratorio

Seguiremos la Ley de Prevención de Riesgos Laborales (Ley 31/95 actualizada por la Ley 54/2003).

Tipos de Residuos y Procedimientos de Eliminación

Clases:

• I. Residuos generales: Papel, cartón, comida, mobiliario, vidrio.
• II. Residuos biosanitarios asimilables a urbanos: Aquellos no incluidos en el grupo III.
• III. Residuos biosanitarios especiales: 9 grupos.
• IV. Cadáveres y restos humanos de entidad suficiente.
• V. Residuos químicos.
• VI. Residuos citotóxicos.
• VII. Residuos contaminados por sustancias radiactivas.

Envasado de Residuos

• Envases de un solo uso: Intactos hasta su eliminación, no deben someterse a presiones mecánicas. Envases rotos o con fugas serán reenvasados.
• Residuos Clase II (también para la clase I):
  • Opacos, impermeables, resistentes a la humedad.
  • Combustión sin emisión tóxica.
  • Volumen no superior a 70 litros.
  • Color verde.
  • Galga mínima 200.
• Residuos Clase III:
  • Envases Rígidos o Semirrígidos: Libres de sustentación, opacos, impermeables, resistentes a la humedad y a la perforación. Provistos de cierre hermético. Combustión sin emisión tóxica. Volumen superior a 60 litros. Tapa debe ser roja y estar señalizados con el pictograma “Biopeligroso”.
  • Envases no rígidos: Opacos, impermeables y resistentes a la humedad. Combustión sin emisión tóxica. Volumen superior a 80 litros. Al menos la tapa debe ser roja y estar señalizados con el pictograma “Biopeligroso”. Galga mínima 300.

Artefactos Histológicos

Artefactos: Alteraciones que pueden observarse en los cortes histológicos. Causados por el procesamiento en el laboratorio:

• Fijación: Distorsión de la forma, el color o el aspecto de la muestra por fijación inadecuada.
• Tallado: No dejar secar las muestras porque puede deteriorar.
• Procesado: Mala deshidratación no dejará penetrar adecuadamente la parafina.
• Corte:
  • Variaciones en el espesor.
  • Rayas o líneas a través de las estructuras biológicas, debidas a cuchilla defectuosa.
  • Pliegues o arrugas por fallo al extender los cortes.
• Coloración: Sobrecoloración, ausencia de coloración.
• Montaje:
  • Dejar secar muestras que no lo requieren.
  • Manipulación inadecuada.
  • Mal montaje entre porta y cubre.

Registro de Muestras

• Siempre al recibir la muestra.
• Manual o automatizado.
• Acompañadas de un volante de petición.

Inclusión de Tejidos

Inclusión

Inclusión: Eliminación completa del agua presente en los tejidos.

Materiales Empleados

• Microscopía óptica: Parafina, celoidina o gelatina.
• Microscopía electrónica: Resinas epóxicas o plásticas.

Pasos: Deshidratación → Aclaramiento o desalcoholización → Infiltración.

Microscopía Óptica

Deshidratación

Deshidratación: Eliminación completa de agua, mediante agentes químicos, reactivos deshidratantes o por procedimientos físico-químicos.

• Mediante el empleo del alcohol etílico en graduaciones crecientes.
• No realizar un mayor número de baños.
• El deshidratante más importante es el alcohol etílico.

Aclaramiento o Desalcoholización

Su finalidad es que la pieza se halle embebida en un agente líquido, en el que pueda disolverse el medio de inclusión y de este modo penetrar en el tejido.

Agentes Aclarantes

• Xileno:
  • Ventajas: Agente aclarante más rápido, no disuelve celoidina, endurece poco los tejidos, se elimina fácilmente del medio de inclusión, el punto óptimo de clarificación es fácil de apreciar.
  • Inconvenientes: Tóxico, solo aclara desde el alcohol absoluto (100%), tiende a volver blanquecino el tejido, endurece si actúa mucho tiempo, tiende a la acidificación.
• Tolueno.
• Benceno.
• Cloroformo:
  • Ventajas: Muy tolerante, no afecta al tejido, lento, útil para tejidos fibrosos, muestras descalcificadas, piel.
  • Inconvenientes: Punto de aclaramiento difícil de precisar, el tejido tiende a flotar en él, difícil de eliminar de la parafina, olor poco agradable.

Infiltración o Impregnación

Proceso cuyo objetivo es «rellenar o infiltrar» totalmente la muestra con el medio que se va a utilizar para la imbibición del tejido.

Infiltración en Parafinas

Las parafinas son sustancias cerosas compuestas por mezclas de hidrocarburos saturados de cadena larga con diferentes puntos de fusión (40-70ºC).

Microscopía Electrónica

Similar al anterior. Cortes obtenidos finos para conservar la estructura celular que queremos observar.

Deshidratación

Agentes más usados:

• Acetona.
• Etanol.

Líquidos Intermedios

Agente que facilite la penetración en el medio de infiltración. Más usados: epoxipropano u óxido de propileno.

Inclusión

De tipo plástico. Entre inconvenientes destacan la viscosidad.

Orientación de la Muestra

Los bloques deben tener dureza homogénea, plasticidad y elasticidad adecuadas para obtener cortes de calidad.

Parafineros

Constan de:

• Dispensador de parafina líquida.
• Placa caliente.
• Placa fría.

Materiales

• Pinzas de inclusión.
• Mechero de alcohol.
• Moldes metálicos.

Consideraciones Generales

• Orientar muestras de forma plana.
• Zona más blanda (debajo), dura (arriba).
• Tratar que se vea y corte la mayor cantidad de muestra.
• Normalmente como lo talló el patólogo.

Orientación según Estructura

• Estructuras tubulares: Corte perpendicular al eje longitudinal del tubo.
• Estructuras quísticas: Superficie de corte hacia abajo.
• Varias piezas: Una junto a otra.

Proceso de Inclusión en Bloques

1. Retirar cassettes del procesador.
2. Colocar cassettes en la placa caliente del parafinero para mantener parafina líquida.
3. Tomar cassette, quitar tapa y mantenerlo sobre placa caliente.
4. Seleccionar molde adecuado.
5. Verter parafina líquida en el molde y colocarlo en la placa caliente.
6. Calentar pinzas, tomar muestra y colocarla en el molde.
7. Colocar el molde con la muestra en la placa fría para solidificar.
8. Tomar cassette con la identificación.
9. Llenar molde con más parafina líquida y colocarlo en placa fría.
10. Separar molde del cassette cuando esté listo.

Otras Técnicas de Procesamiento

1. Inclusión en gelatina: Se utiliza para cortes macrométricos de órganos completos. Al ser soluble en agua no es necesario deshidratar y aclarar, aunque sí debe eliminarse el fijador.
2. Inclusión en celoidina: Se emplea en trabajos neurohistológicos, muestras duras, frágiles o de gran heterogeneidad. No pueden obtenerse cortes de menos de 10 micras de grosor y su procesado puede ser de varias semanas.
3. Inclusión en medios hidrosolubles: Se utilizan para demostrar elementos intratisulares que pueden desnaturalizarse por calor o por agentes deshidratantes como enzimas o lípidos. El más usado es el polietilenglicol y derivados.
4. Inclusión en plástico (resinas): Por ejemplo, metilmetacrilato, butilmetacrilato. Se emplean en estudios de tejido óseo sin descalcificar o materiales de elevada dureza, conservan la estructura excepcionalmente.

Microtomía

Componentes del Microtomo

• Portabloques: Donde colocamos el material tisular sumergido en algún medio de inclusión.
• Portacuchillas: Dispositivo de fijación basado en una pinza que sujeta y orienta adecuadamente la cuchilla.
• Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla: Sistema mecánico o electrónico que proporciona cortes sucesivos de tejido a partir del bloque.
• Base: Para sustentar el microtomo a la mesa.
• Caja: Aloja el mecanismo de engranajes de precisión y el mecanismo para seleccionar el espesor de la sección.
• Manivela: Situada a la derecha del aparato; consiste en un volante con una manilla y un freno.
• Freno: Tornillo acondicionándolo hacia afuera.
• Manivela de recuperación: Situada a la izquierda del microtomo.

Tipos de Microtomo

• Microtomo de oscilación: El más empleado.
  • Portabloque colocado en posición vertical se mueve de arriba abajo.
  • Delante del filo de la cuchilla el portabloque avanza de manera automática y constante en cada vuelta del mango.
  • Mecanismo de avance de tornillo.
  • Simple y bajo coste.
  • No permite obtener secciones seriadas.
• Microtomo de deslizamiento.
• Microtomo de congelación: Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y por tanto no deshidratado.
• Ultramicrotomo:
  • Muestras para microscopios electrónicos de transmisión.
  • Disponen de cuchillas especiales.
  • Permite un grosor de 10 a 500 nm.
• Microtomo de Rotación o Minot:
  • Únicamente realizar cortes en tejidos blandos y sin grandes complicaciones.
  • Se maneja vía un volante.
  • Existe sistema mecánico que permite orientar la superficie de corte de la muestra respecto a la cuchilla.
  • Tiene más precisión y permite obtener secciones seriadas muy finas.
  • Imposibilidad de cortar con él tejidos incluidos en celoidina, en gelatina y en propilenglicol.
  • Permiten muestras entre 1 y 60 µm.
• Microtomo de Láser:
  • Permite cortar de forma muy fina las pruebas sin causar daño térmico al material.
  • Permiten muestras con un grosor de entre 10 y 100 micrómetros.
• Criostato:
  • No utiliza medio de inclusión.
  • Introducido en cámara frigorífica especial a -15 o -20ºC.
  • En sus cámaras frías, permiten cortes de entre 4 y 2 micras.
  • Utilizado en biopsias intraoperatorias y para los estudios histoenzimáticos o inmunohistoquímicos.

Coloración Histológica

Tipos de Colorantes

Según su origen:

• Naturales: Proceden de elementos existentes en la naturaleza, escasos y se obtienen en forma de extractos a partir de plantas o insectos. De forma rutinaria, los más conocidos son: hematoxilina, carmín y orceína.
• Artificiales: La mayoría derivados de la sustancia química denominada anilina.

Tipos de Colorantes Nucleares

Tiñen de manera específica el núcleo celular, definiendo su contorno.

• Hematoxilinas: Para poder usarse debe ser oxidada a hemateína (maduración).
  • H de Harris: La más empleada en coloración rutinaria de núcleos celulares.
  • H de Mayer: Muy selectiva para colorear cromatina nuclear.
  • H. ácido de Ehrlich: Tinción nuclear menos intensa que las anteriores pero más uniforme.
  • Hemalumbre de Delafield: Colorea núcleos celulares de azul muy suave.
• Colorantes Xanténicos:
  • Eosina y Floxina: Tienen autoflorescencia espontánea y colorean tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosa.
  • Naranja G: Uno de los mejores colorantes del citoplasma al que da color naranja. También para teñir tejido conectivo.

Coloración Hematoxilina-Eosina (H&E)

La más utilizada en histología.

• Colorea las estructuras ácidas de color azul purpúreo (por la hematoxilina).
• Posteriormente actúa la eosina, al ser ácida teñirá estructuras básicas como las proteínas, de rosa.

1. Preparación del Tejido

• Fijación: Puede usarse cualquier solución fijadora salvo las que contienen tetróxido de osmio.
• Desparafinar: Para que los colorantes penetren, los cortes deben desparafinarse:
  • Incubadora a 60ºC 3 minutos.
  • 3 baños rápidos en xilol, el último debe ser más prolongado (3-5 minutos). Agitar suavemente.

2. Fundamento

• Hematoxilina: Colorante básico, carga positiva, catiónico. Sustancias teñidas por básicos se denominan basófilas.
• Eosina: Colorante ácido, carga negativa. Aniónico. Sustancias teñidas por ácidos se denominan acidófilas.

3. Protocolo

1. Desparafinar: Xileno.
2. Hidratación de la muestra: Batería de alcoholes de graduación decreciente.
3. Coloración nuclear con hematoxilina.
4. Lavar con agua corriente.
5. Diferenciación: Retirar exceso de hematoxilina con alcohol ácido durante 5-30 segundos. Para favorecer la entrada del colorante citoplasmático.
6. Viraje: Azular en agua corriente u otro agente 5 min.
7. Eosina 20-60 seg.
8. Lavar con agua corriente hasta obtener intensidad deseada.
9. Deshidratación: Retirar agua del tejido para posterior montaje.
10. Aclarado: Xileno para eliminar restos de alcohol absoluto.

Montaje y Conservación

• Colocar sobre el corte coloreado 1 gota de sustancia adherente.
• Colocar 1 gota en un extremo del corte y se deja caer suavemente el cubre, evitando burbujas y limpiando el exceso.

5. Resultados

La causa más común de tinción inadecuada es mala fijación tisular.

• Exceso o defecto de oxidación de la hemateína.
• Exceso o defecto de diferenciación.
• Empleo de hematoxilina vieja o usada en exceso.

Coloraciones y Tinciones Específicas

Coloraciones para Lípidos

Se dividen en:

• Lípidos homofásicos: En los tejidos en estado puro concentrados en un territorio particular de la célula.
• Lípidos heterofásicos: Mezclados con otras sustancias. Se usa en técnica PAS.

Las técnicas son:

• Sudán III y IV: Tiñe lípido rojo intenso a naranja-rojizo.
• Sudán negro para lípidos: Tiñe núcleos y citoplasma de rojo, lípidos y mielina de negro.
• Azul de Nilo: Tiñe grasas neutras de rosa a rojo y ácidos grasos de azul oscuro.

Técnica de Coloración para el Glucógeno

• El carmín de Best se usa exclusivamente para glucógeno.
• Tiñe núcleos de azul negruzco y glucógeno de rojo.

Técnica de Coloración para Mucina

• El carmín de Mayer sirve para detectar mucinas epiteliales.
• Interpretación: Mucina ácida de rosa, núcleos negros y fondo amarillo.

Técnica de Coloración de Tejido Conjuntivo

• Para tinción de colágeno las técnicas más usadas son inmunohistoquímicas.
• Entre las no inmunohistoquímicas destacan:
  • Para fibras colágenas: Picro-fucsina de Van Gieson, tinción tricrómica. Tiñe los núcleos de azul negruzco, los citoplasmas amarillos y las fibras colágenas rojo intenso.
  • Para fibras elásticas:
    • Método de orceína: Tiñe fibras elásticas entre burdeos y castaño oscuro y el resto de marrón pálido.
    • Método de hematoxilina de Verhoeff: Tiñe fibras elásticas de negro, los núcleos de gris a negro, las fibras colágenas de rojo y los citoplasmas celulares de amarillo.

Coloraciones no Argénticas para Tejido Nervioso

• Cresil violeta: Para detección de cuerpos de Nissl, para identificación células nerviosas en tejido y para evaluar si hay daño neuronal.
  • Tiñe grumos de Nissl y núcleos de violeta, células nerviosas azul tenue y el resto no se tiñen.
• Hematoxilina ácida fosfotúngstica: Identificación de astrocitos de la glía, para daños o patologías del SNC relacionados con los astrocitos.
  • Tiñe neurofibrillas y miofibrillas de azul negruzco, axones de azul pálido a negro, colágeno de rojo y astrocitos de rojo pálido.
• Luxol fast blue: Identificación de patologías de la mielina.
  • Tiñe la vaina de azul o verde-azulado y las neuronas y grumos de Nissl de violeta o rosado.

Tinciones para Bacterias

• Tinción de Gram:
  • La pared de bacterias G+ tiene una gruesa capa de peptidoglicano y 2 tipos de ácidos teicoicos.
  • La pared G- tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas.
  • Las G+ se tiñen de azul-violeta, mientras que las G- lo hacen de rosa.
• Tinción para bacterias ácido-alcohol resistentes: Micobacterias no se tiñen bien con técnica de Gram.
  • En este caso se utiliza la técnica de Ziehl-Neelsen.

Coloraciones para Hongos

• En general son PAS y Gram positivos en caso de formar hifas; y PAS+ y G- cuando se encuentran en forma de esporas.
• También se utiliza la técnica de la plata metamina, junto con el PAS, colorea los hidratos de carbono presentes en la cápsula.

Coloraciones para Virus

• La orceína de Shikata: Se usa en biopsias hepáticas por permitir observar los virus reproduciéndose en el interior de los hepatocitos, que tendrán aspecto de vidrio esmerilado y los citoplasmas aparecen marrones o negruzcos.

Tinciones Usadas en Parasitología

• H&E o Papanicolau: Para Trichomonas vaginalis (Protozoos flagelados).
• PAS: Para Echinococcus granulosus.
• Giemsa: Está formado por azul de metileno y eosina. El primero tiñe los ácidos nucleicos y colorea cocos y bacilos, mientras que la eosina tiñe los citoplasmas y define morfología celular.

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