MICROSCOPIO

La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la «Accademia dei Lincei». Se deriva de las palabras griegas «micro» (pequeño) y «skopein» (ver).

FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPÍA

Cuando el observador se acerca a un objeto, este se agranda. Sin embargo, a menos de 25 cm no se ve con claridad. Si se aumenta el ángulo visual con un sistema óptico, se puede ver con claridad.

PARÁMETROS ÓPTICOS

Aumento

Es la relación existente entre el tamaño de un objeto percibido a simple vista y el apreciado con el microscopio. Indica el número de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor real. El aumento total se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular.

Poder de Resolución

Es la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes, de mostrar los detalles más finos de un objeto. Influye en la nitidez de la imagen. Hay tres métodos para disminuir la distancia resoluble o aumentar el poder de resolución:

1. Mayor resolución con menor longitud de onda de la luz.
2. Mayor resolución con mayor apertura numérica.
3. Mayor resolución con aceite de inmersión.

Número de Campo

Es el diámetro de la imagen observada a través del ocular, expresado en milímetros.

Profundidad de Foco

Es el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo.

Contraste

Es la diferencia de absorción de luz entre el objeto y el medio. Puede aumentarse con las tinciones o cerrando el diafragma.

PARTES DEL MICROSCOPIO

Parte Mecánica

Sistema de Soporte o Estativo

• Pie: Base del microscopio.
• Brazo: Une el pie con el cabezal.
• Cabezal: En los extremos están alojados los oculares y los objetivos.
• Platina: Placa horizontal que sostiene las preparaciones a observar. Sale del brazo y consta de:
  • Un orificio central que permite el paso de la luz.
  • Una pinza que sujeta el portaobjetos.

Sistema de Ajuste

• Anillo de ajuste de las dioptrías.
• Tornillo de fijación del cabezal.
• Tornillos reguladores de la platina para deslizar el portaobjetos.
• Tornillo de elevación del condensador.
• Tornillos de centrado del condensador.
• Tornillo de seguridad del condensador.
• Control del diafragma de apertura del condensador.
• Anillos de enfoque: macrometrico y micrometrico.
• Control de ajuste de la claridad de la luz.

Parte Óptica

Sistema de Iluminación

• Fuente de luz: Lámpara halógena de intensidad graduable en el pie del microscopio.
• Condensador: Dispositivo que contiene una lente que concentra la luz hacia la preparación.
• Diafragma de apertura: Controla la iluminación que atraviesa la muestra y entra en el objetivo.

Lentes

• Objetivos: Generan una imagen real, invertida y aumentada del objeto. Se encuentran en el revólver y tienen un sistema de amortiguación. Un anillo coloreado indica los aumentos (4x, 10x, 40x y 100x inmersión).

MATERIAL PARA VISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA

• Portaobjetos: Lámina de vidrio que sirve de soporte para la muestra.
• Cubreobjetos: Lámina fina de vidrio que sirve para cubrir la muestra.
• Líquido de inmersión: Se utiliza con el objetivo de inmersión (100x) para mejorar la resolución. Los sintéticos son mejores que el aceite de cedro porque no secan tan fácilmente.

MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. No poner la preparación al revés.
2. Regular la luz a intensidad media.
3. Ajustar condensador y diafragma al medio.
4. Empezar por poco aumento.
5. Ajustar los oculares.
6. Mirando por fuera, subir la platina.
7. Enfocar y ajustar.
8. Pasar al siguiente aumento y enfocar.
9. Al acabar, retirar la preparación.
10. Apagar la luz.
11. Limpiar el aceite.

CONSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

• Ponerle su funda al guardarlo.
• Limpiar las lentes con papel de gafas y alcohol-éter.
• Usar pincel y pera de aire para la limpieza.
• Evitar el transporte y si es necesario hacerlo con cuidado.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

1. Microscopio Óptico

1.1. Microscopio Óptico Simple

1.1.1. Lupa

Se utiliza para exámenes superficiales, como la disección de animales, observación de colonias o detección de quistes de triquina en el músculo del cerdo.

1.2. Microscopio Óptico Compuesto

1.2.1. M.O. Normal

Permite estudiar estructuras internas de la muestra, por lo que debe estar dispuesta en una fina capa que pueda ser atravesada por la luz.

1.2.2. Campo Oscuro

Permite la observación de seres microscópicos transparentes y no teñidos que, a causa de su bajo contraste, son escasamente percibidos con la iluminación de campo claro.

1.2.3. Contraste de Fases

Se utiliza para el estudio de objetos transparentes no coloreados, como los sedimentos de orina.

1.2.4. Fluorescencia

La luz ultravioleta permite ver sustancias fluorescentes. Hay sustancias fluorescentes de forma natural (vitamina A) y otras que hay que teñirlas con sustancias fluorescentes (bacilo de Koch) o con anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes (toxoplasma).

1.2.5. Microscopio de Luz Polarizada

Sirve, por ejemplo, para identificar las distintas sustancias cristalinas que pueden estar presentes en un sedimento urinario.

2. Microscopio Electrónico

2.1. Transmisión

Para ver la muestra, en vez de luz, utiliza un haz de electrones, con una longitud de onda de 10^-7 mm. La muestra tiene que ser muy fina. Se consigue una gran amplificación, pero debido al vacío, no sirve para ver elementos vivos.

2.2. Barrido

La muestra se congela y se cubre con una capa de metal, que emite electrones. Al incidir sobre la muestra el haz de electrones del microscopio, se desprenden electrones del metal de la muestra. Estos generan señales eléctricas que se registran en un monitor. Tiene menos poder de resolución que el de transmisión, pero más profundidad de campo, por lo que produce imágenes tridimensionales.

2.3. Digital

2.4. Efecto Túnel o Cuántico

EXTENSIONES SANGUÍNEAS

CONCEPTO

Un frotis sanguíneo es la formación de una fina película de sangre en un portaobjetos, de manera que las células sanguíneas no se superpongan entre sí.

PARTES

• Cabeza: Es la zona inicial, más gruesa, donde se encuentra una mayor proporción de linfocitos y los hematíes forman aglomerados.
• Cuerpo: Es la zona media, con un espesor apropiado, ideal para visualizar los diferentes leucocitos.
• Cola: Es la zona final, suele tener aspecto redondeado, es la región más fina, se encuentra una mayor proporción de leucocitos grandes, granulocitos o monocitos, y además los hematíes están deformados y presentan una tonalidad uniforme. En su porción terminal suelen ser más abundantes las plaquetas, sobre todo si son grandes.
• Bordes: No deben llegar a ningún extremo del portaobjetos. Contienen una mayor proporción de leucocitos grandes.

CARACTERÍSTICAS DE UNA BUENA EXTENSIÓN

• Ni muy corta ni muy larga, debe ocupar 3/4 partes del portaobjetos.
• La cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del portaobjetos.
• La cola debe estar deshilachada.
• No debe alcanzar ninguno de los cuatro bordes, debe haber 1 mm de separación.
• No debe presentar agujeros ni estrías.
• La disposición de las células debe ser homogénea.
• Secar rápidamente.
• Utilizar sangre recién extraída (capilar o venosa).
• No debe ser ni muy gruesa ni muy fina.

DEFECTOS DE UNA EXTENSIÓN

• Excesiva longitud y escaso grosor, o escasa longitud y excesivo grosor, por un inadecuado tamaño de la gota de sangre o error en la velocidad o ángulo de extensión.
• Presencia de escalones o estrías, ocasionado por una falta de uniformidad en el deslizamiento de la gota.
• Existencia de agujeros.
• Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre por presencia de restos de grasa o suciedad en el portaobjetos.
• Extremo final muy dentado.

TINCIONES HEMATOLÓGICAS

Concepto

Son un conjunto de procesos para conseguir la coloración de las estructuras de las células sanguíneas, aumentando el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, lo que permite que las células se visualicen microscópicamente con mayor facilidad.

Tipos

Según la vitalidad de las células:

• Vitales y no vitales.

Según el momento en el que se empezaron a utilizar:

• Tradicionales y especiales.

Tinciones Vitales y Supravitales

Se efectúan sobre células vivas.

• Tinciones vitales: Introducción de un colorante en un organismo vivo (Ej: azul de metileno).
• Tinciones supravitales: Coloración de una célula o tejido vivo pero fuera del organismo del que procede.

Tinciones No Vitales

Se realizan sobre células muertas, previamente fijadas para conservar su estructura y adherirlas al portaobjetos.

Tinciones Tradicionales y Especiales

Tradicionales

Utilizan colorantes derivados de la anilina:

• Colorantes Ácidos: Eosina, especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina.
• Colorantes Básicos: Azul de metileno, especial afinidad por estructuras ácidas de las células, por ejemplo, ácidos nucleicos.
• Colorantes Neutros: Eosinato de azul de metileno, sales de un ácido y de una base coloreada. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
• Colorantes Indiferentes: Sudan III (se utiliza para teñir grasas). Afinidad por estructuras ácidas o básicas. Insolubles en agua y tiñen aquellas sustancias que tienen poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.

Colorantes de Romanowsky

Se realizan las tinciones con combinaciones de los colorantes tradicionales: Wright, Giemsa, May-Grünwald, panóptico rápido.

Tinciones Especiales

• Fluorescentes: Emplean fluorocromos que se fijan a las células y producen un color característico cuando se observan con luz ultravioleta.
• Citoquímicas: Demuestran la presencia de ciertas sustancias en los gránulos de los leucocitos, que nos sirven para diferenciar las leucemias.

Denominación de las Estructuras Coloreadas

• Acidófilas o eosinófilas: Se tiñen con colorantes ácidos, adquiriendo un color rosado.
• Basófilas: Se tiñen con colorantes básicos y adquieren un color azul.

Causas de Error en las Tinciones Tradicionales

Tinción Demasiado Rosa

• pH demasiado bajo del colorante.
• Tiempo de coloración insuficiente.
• Lavado excesivo.

Tinción Demasiado Azul

• Extensión demasiado gruesa.
• pH alto del colorante.
• Tiempo de coloración excesivo.
• Lavado insuficiente.

Aparición de Artefactos o Precipitados

• Portaobjetos sucios.
• Grumos en el colorante.
• Coloración prolongada o lavado insuficiente.
• Secado del colorante durante la tinción.

FÓRMULA LEUCOCITARIA

1. CONCEPTO

Es el porcentaje de cada tipo de leucocitos que hay en una extensión sanguínea. Para realizarla necesitamos una extensión de sangre teñida.

2. COLORANTES

• Ácidos (eosina): Tiñen de color rosado las estructuras básicas (acidófilas o eosinofilas).
• Básicos (azul de metileno): Tiñen de color azul las estructuras ácidas (basófilas).
• Neutros (mezcla de ácido y base)

LEUCOCITOS

Número normal: 5000 – 11.000 /mm3 en sangre (circulante) (el aumento se llama leucocitosis y la disminución leucopenia).

Clases

• Granulocitos o Polimorfonucleares: Se llaman así porque su núcleo no es redondeado, sino que presentan unas lobulaciones que les hacen adoptar distintas formas.
  • Neutrófilos: metamielocitos, cayados y segmentados.
  • Eosinófilos.
  • Basófilos.
• Agranulocitos o Mononucleares:
  • Monocitos.
  • Linfocitos.

FÓRMULA LEUCOCITARIA NORMAL

• Segmentados: 40-75% (valor alto: neutrofilia, valores bajos: neutropenia).
• Cayados: 1-4(3-5)% (valor alto: desviación a la izquierda, valores bajos: desviación a la derecha).
• Eosinófilos: 0-7% (valor alto: eosinofilia, valores bajos: eosinopenia).
• Basófilos: 0-2% (valor alto: basofilia, valores bajos: basopenia).
• Monocitos: 3-9% (valor alto: monocitosis, valores bajos: monocitopenia).
• Linfocitos: 20-40% (valor alto: linfocitosis, valores bajos: linfopenia).

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