• Cromatografía de Reparto
• La cromatografía líquida considerada como clásica se lleva a cabo en columnas abiertas de vidrio y en ella la fase móvil fluye por gravedad o mediante la aplicación de vacío, la longitud de la columna debe ser, por lo menos, equivalente a diez veces su diámetro.

• Hay cinco métodos cromatográficos:

• Cromatografía de Reparto: Cromatografía en fase normal. Cromatografía en fase reversa.

• Cromatografía iónica.

• Cromatografía de Exclusión.

• Cromatografía de adsorción.

• La eficacia de las columnas aumenta a medida que disminuye el tamaño de las partículas del relleno, si bien, en este caso, la fase móvil fluye con mayor dificultad. Para solucionar las dificultades derivadas del empleo de fases estacionarias de tamaños muy pequeños (entre 3 y 10 μm), se requiere una instrumentación sofisticada.

• Cromatografía de Reparto
• La más utilizada, para compuestos polares, no iónicos, de baja a moderada masa molecular (<>)
• Más recientemente para compuestos iónicos derivatizados (formación de pares iónicos).
• Líquido-líquido: fase estacionaria unida por adsorción física
• Desventaja: pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil

• Fase unida químicamente: soporte más común es la sílice. (Diámetro entre 3, 5 o 10 μm); porosidad (hasta 0.80 μ).
• Rellenos tipo siloxano para fase inversa: Grupo R: C8 (n-octilo), C18 (n-octadecilo)
• Mecanismos de retención de solutos (por disolución, equivalente a una fase líquida no polar, por adsorción física
• Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de siloxano en fase inversa
• pH<7,5 para evitar hidrólisis del >7,5>

• Cromatografía en fase normal
• Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre sílice o alúmina y fase móvil apolar.
• Solventes no polares (etiléter, cloroformo y n-hexano).
• Rellenos tipo siloxano para fase normal: amino (C3H6NH2) (los más polares)
• – diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia)
• – dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia)
• – ciano (C2H4CN) (los menos polares)
• Competencia del disolvente y del analito por el relleno es determinante de los factores de retención.

• Cromatografía de fase inversa
• Fase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase móvil polar (agua, metanol, acetonitrilo)
• Cambios de solvatación del analito en el disolvente es determinante por cambios de factores de retención.
• Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y selectividad se controla fundamentalmente con la composición de la fase móvil
• Sílice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos días μmol/m2 de grupos OH
• Inmovilización química (90% de rendimiento)
• Si- OH + X- Si- (CH2)n- L -Si- O-Si- (CH2)n-L
• sílice organoclorosilano siloxano
• n = 8 o 18
• L: metil, amino, carboxil, ciano, diol
• Recubrimiento máximo 4 μmol/m2 de grupos.
• Silanos residuales se desactivan con clorotrimetilsilano
• Actualmente, el 75% de los análisis con HPLC se realizan en fase reversa. Permite un análisis directo de muestras acuosas y de compuestos solubles en agua o en disolventes relativamente polares (metanol) y con peso molecular no superior a 2000 o 3000 ua.

• Criterios de selección
• – Polaridad de la fase estacionaria similar a la de los analitos. (Evitar tiempos de retención muy altos).
• – Fase móvil con polaridad distinta a la fase estacionaria
• – Polaridad creciente:
• Hidrocarburos < éteres > ésteres > cetonas > aldehídos > amidas < aminas > alcoholes
• – k’ (factor de retención) entre 2 y 5

• Selectividad :
• – En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano. Agua para ajustar k’.
• – En fase normal se ajusta con etiléter, cloruro de metileno y cloroformo, n-hexano para ajustar k’.

• Formación de derivados

1) Reducción de polaridad que haga posible el uso de cromatografía de reparto

2) aumento de respuesta del detector

3) aumento de selectividad de la respuesta

Cromatografía de pares iónicos

Fase móvil: agua + disolvente orgánico (metano o acetonitrilo + compuesto iónico con contraión de carga opuesta a la del analito.

Contraión forma un par iónico con el analito: especie neutra retenida por el relleno de fase inversa.

Cromatografía con fases estacionarias quirales

Más apropiada en HPLC que en CG

Relleno recubierto con un isómero ópticamente activo.

• Cromatografía

Significa ‘Escribir en Colores’.

Los componentes de una mezcla pueden presentar una tendencia diferente a permanecer en cualquiera de las fases involucradas. Es la separación de dos o más compuestos químicos en un medio.

• Aspectos históricos de la cromatografía

La técnica de cromatografía aparece en 1850. El químico F.F. Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel. En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna para separar extractos vegetales coloreados. Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía. En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica. Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente. A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial. En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel por sus trabajos en 1948. Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el campo de la bioquímica. Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados.

Conceptos generales La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas asociadas al principio de retención selectiva.

Permite separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Posee:

– Fase móvil: consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico).

– Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido.

Los componentes de la mezcla interaccionan en forma diferente con la fase estacionaria y con la fase móvil. Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando.

Tipos de cromatografias

Cromatografía plana: La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.

– Cromatografía en papel

– Cromatografía en capa fina

• Cromatografía en columna: La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.
• Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:

– Cromatografía de líquidos-Cromatografía de gases – Cromatografía de fluidos supercríticos

• Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía
• Cromatografía en papel Fue desarrollada por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa. Es una técnica sencilla y presenta la ventaja de poder utilizar cantidades pequeñas de muestra (miligramos y microgramos).
• Cromatografía en capa fina. Fue originada en 1938 por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen. Lograron separar mezclas de tinturas farmacéuticas. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte (silica). Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos.
• Cromatografía de columna. Consiste en la aplicación de una muestra compleja a una columna de cristal. Contiene una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. Se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes mezclas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz. Se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.
• Naturaleza de las fuerzas de partición La distribución de un soluto entre las dos fases es el resultado del balance de las fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, o bien pueden deberse a las fuerzas de dispersión de London. En la cromatografía de intercambio iónico, las fuerzas son de naturaleza sustancialmente iónica.
• Interacción de dispersión Esta interacción se debe a los dipolos constantemente cambiantes formados entre los núcleos y los electrones, en el movimiento del punto cero de la molécula que actúa sobre la polarizabilidad de otras moléculas para producir dipolos inducidos en fase.
• Interacción dipolo-dipolo Esta interacción dipolo-dipolo conduce a la asociación de líquidos o pares líquidos-soluto. Las únicas sustancias que pueden producir la separación de moléculas de disolventes y mezclarse con ellas, son aquellas cuyas atracción para las moléculas polares del disolvente es tan fuerte como la atracción mutua.
• Interacciones de enlaces de hidrógeno Los dipolos capaces de formar enlaces de hidrógeno tienen un comportamiento excepcional. La fuerza real de un enlace de hidrógeno depende de la geometría dela combinación específica, de la naturaleza de los átomos vecinos, de la resonancia y el carácter acido-base.
• Definiciones cromatográficas
• Coeficiente de distribución: K = CS/CM
• Tiempo de retención: TR
• Tiempo muerto: TM
• Velocidad lineal media: v = u x ft
• Velocidad de migración: u

v = u x __1____

1 + kvs/vM

Factor de capacidad de una especie A:

k’A = kA vs/vM

k’A = TR – TM

TM

Factor de selectividad para dos especies A y B

α = kB/kA = k’B / k’A = (TR)B – TM

(TR)A – TM

Altura de platos teóricos: H = δ²/L

Nº de platos teóricos: N = L/H

Ecuación de Van Deemter

H = A + B/u + (Cs + CM)u

A = Trayectoria seguida por las partículas

B = Difusión longitudinal

C = Resistencia a la transferencia de masa

Etiquetas: columna, cromatografía, métodos cromatográficos