Estudio de Talasemias y Hemoglobinopatías Estructurales: Métodos de Laboratorio

Diagnóstico de Hemoglobinopatías Estructurales

Para el estudio de las hemoglobinopatías estructurales se utilizan las siguientes pruebas de laboratorio:

• Hemograma: Detección de anemia.
• Frotis sanguíneo: Observación de morfología eritrocitaria anómala (ej. drepanocitos en HbS, dianocitos, etc., según la hemoglobina anómala).
• Electroforesis de Hemoglobinas: Técnica de separación de proteínas basada en su distinta migración en un campo eléctrico en virtud de su carga eléctrica.

Principios de la Electroforesis de Hemoglobinas

La hemoglobina, en condiciones fisiológicas, tiene carga negativa (-). Sometida a un campo eléctrico sobre un soporte, migra hacia el polo positivo (ánodo). Cuanto mayor sea la carga negativa, mayor será la velocidad de migración hacia el ánodo.

El pH al que se realiza la electroforesis es un punto importante, ya que de él depende la carga de cada tipo de hemoglobina.

Electroforesis Alcalina (Acetato o Gel de Agarosa)

El tipo de electroforesis más utilizada es la electroforesis a pH alcalino (8.2-8.6). A este pH, la hemoglobina está cargada negativamente y migra hacia el ánodo (+).

El patrón electroforético de un individuo sano consta de tres bandas:

• Una banda intensa de HbA.
• Una banda débil de HbA2 (a veces imperceptible).
• Una banda muy tenue de HbF.

La presencia de hemoglobinas anómalas se detecta por la aparición de bandas extra entre las bandas de HbA y HbA2, o bien por un aumento en la intensidad de la banda de HbA2, ya que varias hemoglobinas anómalas migran en la misma posición que la HbA2.

Dado que varias hemoglobinas anormales migran en las mismas posiciones (coincidiendo con la HbA2 o entre la HbA2 y HbA), cuando se detecta una banda anómala, está indicada la realización de una nueva electroforesis, pero a pH ácido.

Cuantificación de Bandas por Densitometría de Barrido

Se genera un pico por cada banda, proporcional en tamaño a la intensidad de la tinción de la banda (que a su vez depende de la cantidad de Hb presente). Esta técnica presenta una sensibilidad limitada.

Electroforesis Ácida (Gel de Agarosa)

A un pH ácido (6.0-6.2) las hemoglobinas tienen carga positiva y migran hacia el polo negativo (cátodo). La electroforesis ácida permite la separación de la HbS y de la HbC.

• No se obtienen gráficas, solo se confirman bandas.
• No se obtienen porcentajes.

Nota: La HbC es la única hemoglobina que a pH ácido mantiene una ligera carga negativa.

Ventajas e Inconvenientes de la Electroforesis Alcalina/Ácida

Ventajas:

• Costo-efectiva.
• Permite distinguir las principales hemoglobinas anómalas.

Inconvenientes:

• Técnica laboriosa: requiere obtener hematíes lavados.
• No permite la identificación de algunas hemoglobinas anómalas.
• La cuantificación es preferible con HPLC o Electroforesis Capilar (EC).

Otras Técnicas de Separación y Cuantificación

Electroforesis Capilar (EC)

Permite la separación de las hemoglobinas y sus variantes más comunes, así como la cuantificación precisa de la HbA2 y HbF. La separación se lleva a cabo en el interior de un capilar de sílice (aproximadamente 25 micras de diámetro) al aplicar un alto voltaje (hasta 10,000 voltios), permitiendo una separación rápida y de alta resolución. Los resultados de las migraciones se representan en forma de picos.

Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC)

Es el método de elección para la identificación y cuantificación de las hemoglobinas anómalas.

Diagnóstico de Talasemias

Para el diagnóstico de talasemias en el laboratorio se utilizan las siguientes pruebas:

• Hemograma: Anemia microcítica e hipocrómica. Presencia de reticulocitosis.
• Frotis sanguíneo: Hematíes microcíticos e hipocromos. Presencia de dianocitos.
• Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC): Cuantificación de hemoglobinas (HbA2, HbF, HbH y Hb de Bart).
  • En las β-talasemias se detecta un aumento en la concentración de HbA2 (>3.5 %), debido principalmente a un aumento en la síntesis de cadena δ, y de HbF en el 50% de los casos.
• Técnicas de Biología Molecular (PCR, secuenciación de ADN): Se utilizan para detectar mutaciones concretas. Son la primera opción para el diagnóstico de α-talasemias.

Pruebas Específicas para la Anemia Falciforme (Drepanocitosis)

Siempre que aparezca una banda anómala correspondiente a la Hb S al realizar una electroforesis, se deben realizar pruebas adicionales:

Test de Falciformación

Consiste en colocar en un portaobjetos una gota de sangre total anticoagulada con EDTA y dos gotas de metabisulfito sódico al 2% fresco. Posteriormente se coloca un cubre y se deja reposar.

• El metabisulfito sódico reacciona con la hemoglobina S, haciendo que los glóbulos rojos se deformen y adopten forma de hoz (drepanocito).
• Se observa al microscopio cada 15 minutos y hasta los 45 minutos.
• La prueba se considera positiva si en alguna de las observaciones se detectan drepanocitos.

Cuantificación de Hemoglobina S

Se realiza mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Esta técnica separa las variantes de hemoglobina para identificar y medir la cantidad de cada una. Este procedimiento es crucial para diagnosticar la anemia falciforme y otros trastornos de la hemoglobina, ya que detecta la presencia y el porcentaje de hemoglobina anormal.

Pruebas para el Diagnóstico de la Enfermedad por Hb H

Detección de Cuerpos de Inclusión de HbH

Para el diagnóstico de la enfermedad por Hb H, se incuba la sangre anticoagulada con EDTA con azul de cresil brillante a 37 °C, durante 3 horas. Se observa una granulación fina de color azul-verdoso en el interior del hematíe.

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