Tópicos Selectos en Biotecnología

Terapia Génica: Concepto y Fundamentos

La Terapia Génica se define como la transferencia o introducción de material genético (ácido nucleico) a una célula eucariota con el propósito de alterar el curso de una enfermedad o corregir una alteración metabólica o genética.

Es una estrategia terapéutica basada en la modificación del repertorio genético de células mediante la administración de ADN o ARN, destinada a curar enfermedades de origen tanto hereditario como adquirido.

A partir de 1990, los protocolos experimentales y clínicos de terapia génica registrados y aprobados por la FDA (Estados Unidos) aumentaron de forma creciente. Este campo se relaciona estrechamente con áreas como los animales transgénicos, la clonación, la nutrigenómica, la nutrigenética y las aportaciones del Proyecto del Genoma Humano a la medicina.

Opciones en la Manipulación Genética

Las enfermedades que pueden tratarse con esta estrategia terapéutica son variadas e incluyen desde las monogénicas hereditarias hasta las poligénicas e infecciosas. Debido a ello, cada enfermedad requiere un abordaje particular, por lo que las opciones en la manipulación genética pueden dividirse en los grupos siguientes:

• a) Adición génica: Consiste en insertar un gen funcional que exprese la proteína terapéutica en el tejido indicado. Se puede usar para corregir genes defectuosos, insertar genes con funciones nuevas a células particulares o incrementar la expresión del gen de interés.
• b) Supresión génica: El objetivo es disminuir o anular la expresión de algún gen o genes a través de ARN de ARNi, oligonucleótidos antisentido o ribozimas. Esta estrategia también se aplica a la generación de animales knockout, mediante mutagénesis dirigida para generar un gen disfuncional, cuya función estará ausente en el organismo resultante de la clonación.

Clasificación y Tipos de Terapia Génica

Según el Tipo Celular

Según las células a las que se les aplique, la terapia génica puede dividirse en dos categorías:

• Terapia génica en células germinales (Terapia Eugénica). Va dirigida a células germinales (espermatozoides y óvulos). Al insertar genes en estas células se provoca un cambio genético permanente en el organismo que se deriva de esa célula, por lo que la modificación genética la adquieren generaciones posteriores. Este tipo de terapia no se permite en humanos, debido a las enormes implicaciones éticas que conlleva.
• Terapia génica en células somáticas. En este tipo de estrategia, uno o más tejidos son sometidos a terapia génica mediante administración sistémica, tratamiento directo o previa extirpación del tejido. Además, este procedimiento involucra la transfección de material genético en prácticamente cualquiera de las células del organismo y es el que se aplica en los protocolos clínicos.

Según su Metodología

Según el procedimiento utilizado para introducir el gen terapéutico, la terapia génica se divide en tres categorías:

1. Terapia génica ex vivo. Este método se basa en la obtención y el aislamiento de un tipo celular específico del paciente que se va a tratar; estas células se cultivan en el laboratorio, donde se les introduce el gen terapéutico con ayuda de un vector. Una vez que se tiene la certeza de que las células expresan el gen terapéutico, se introducen nuevamente al paciente.
2. Terapia génica in vivo. Este método consiste en la introducción directa del gen terapéutico al torrente sanguíneo del paciente, que llegará al órgano blanco, o bien se administra directamente en el órgano o tejido (músculo, piel, etc.) blanco dentro del organismo.
3. Terapia génica in situ. Se trata de una microinyección que introduce el ácido nucleico directamente a la célula, para lograr la obtención de organismos recombinantes. También se aplica en la denominada terapia génica “suicida”, que expresa los genes solo en las células malignas.

Métodos de Envío de Genes (Vectores)

Los vehículos utilizados para la transferencia de genes a células somáticas pueden dividirse en dos categorías: vectores no virales y vectores virales.

La transferencia de genes por un vector viral se denomina transducción y la que se realiza por un sistema no viral se denomina transfección.

Transferencia de Genes por un Vector No Viral

Los métodos no virales de envío de genes basan su acción en la entrega directa de la información genética dentro de la célula blanco. Si bien estos sistemas muestran una baja toxicidad y, en general, su costo es bajo, la transferencia de genes es generalmente ineficiente y transitoria. Estos procedimientos se dividen, a su vez, en físicos y químicos.

Métodos Físicos

1. Electroporación: Se utiliza para cultivos celulares y consiste en el uso de una celda donde se colocan las células, que se adapta a un electroportador que genera una corriente eléctrica del orden de milivoltios, con una duración de milisegundos, para generar orificios en la membrana celular. A través de estos orificios se introduce el material genético, generalmente por precipitación de complejos ADN-sales.
2. Bombardeo de partículas: Es el método de elección para la transfección de células vegetales, ya que la pared celular es un obstáculo físico que bloquea de manera natural la transducción. También se le conoce como pistola de genes y consiste en el uso de un aparato de balística que dispara macropartículas de oro, rodeadas de ADN plasmídico. La fuerza aplicada permite que estas partículas atraviesen la pared celular y depositen el material genético en el citoplasma de la célula.
3. Microinyección: La microinyección consiste en la inyección directa de ADN en el núcleo celular mediante una microjeringa y un microscopio óptico, llamado micromanipulador, para poder introducir el material genético a una célula blanco. Se utiliza principalmente para la producción de animales transgénicos. Tiene el inconveniente de que solo transduce una célula al mismo tiempo y requiere material y personal especializado, pero su eficiencia es alta.

Métodos Químicos

• Precipitación con fosfato de calcio: Los coprecipitados de fosfato de calcio ($ ext{CaPO}_4$) y de ADN se utilizan para la transferencia de información genética en células tanto bacterianas como eucariotas. Consisten en formar un precipitado insoluble entre el cloruro de calcio y el ADN en una solución salina de fosfatos. Estos precipitados forman microagregados que se depositan sobre la membrana celular y, posteriormente, son endocitados. Es la técnica más difundida para la producción de líneas celulares transfectadas de forma estable y la de elección para experimentos in vitro por su bajo costo. Además, es un método rápido, simple y puede utilizarse en diversas líneas celulares.
• DEAE-Dextran: Esta técnica difiere de la del fosfato de calcio en que se emplea solo para la transfección transitoria de células y se utiliza de manera eficiente solo en algunas líneas celulares eucariotas; debido a su toxicidad, no resulta adecuada en otras. Se desconoce el mecanismo por el cual el DEAE-Dextran permite la entrada de ADN a las células y su transporte hasta el núcleo, pero se asume que los complejos formados por el DEAE-Dextran y el ADN se adhieren a la superficie celular y entran por endocitosis.
• Liposomas: Esta técnica se basa en el uso de moléculas lipídicas de carga neta altamente positiva (catiónicas) que interactúan con el esqueleto fosfatado de la molécula de ADN. Estos polímeros de poliamidoaminas y lipopoliaminas con cargas positivas se unen electrostáticamente a las negativas del ADN y forman vesículas multilaminales que interactúan con los lípidos de la membrana celular, lo que facilita la transferencia de los ácidos nucleicos al interior de las células. También se conoce que a pH fisiológico estas moléculas contienen residuos protonables, lo que permite el control del pH del endosoma y, por tanto, la protección del ADN de la degradación por el sistema lisosomal.

Transferencia de Genes por un Vector Viral (Transducción)

Los vectores virales son virus manipulados genéticamente para eliminar su capacidad autorreplicativa y permitir que en su genoma puedan incorporar genes terapéuticos. Una vez dentro de la célula, pueden quedarse de manera episomal o integrarse al genoma de la célula, para posteriormente emplear la maquinaria enzimática celular y producir la proteína transgénica deseada.

Los vectores virales emplean los mecanismos naturales de infección viral para introducirse en la célula, generalmente a través de receptores celulares, e introducir el gen terapéutico que contienen. Los vectores virales ofrecen grandes ventajas respecto a los no virales, y en general presentan una alta capacidad para transducir células, por lo que son los modelos de elección para protocolos clínicos de terapia génica in vivo.

Los virus que se utilizan como vectores virales son retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus y baculovirus. Para su uso como vectores, los virus se modifican genéticamente para que sean deficientes en replicación, y en algunas ocasiones se les modifica la cápside, con la finalidad de dirigir o redirigir su célula blanco. Cada uno de estos vectores posee ventajas y limitaciones respecto a los otros, según el gen terapéutico que transporten, el tipo celular y la vía de administración.

Condiciones de un Vector Viral Ideal

En general, un vector ideal para utilizarse en terapia génica debe cumplir las siguientes condiciones:

• Su producción debe ser fácil y eficiente.
• No debe ser tóxico o inducir reacciones inmunológicas en el paciente.
• Debe ser capaz de infectar a células tanto en reposo como en replicación.
• Debe transducir tipos celulares de manera específica.

De acuerdo con su capacidad de integrarse en el genoma de la célula huésped, los vectores pueden clasificarse como vectores integrativos (basados en retrovirus) o no integrativos (incluyen virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1), adenovirus y virus adenoasociados).

Animales Transgénicos y Clonación

El rápido avance de la investigación biotecnológica ha favorecido el desarrollo de metodologías que permiten introducir, eliminar o modificar de forma específica un gen o determinados tipos de genes en el genoma de un organismo, para producir seres con características nuevas y mejores, o bien para que pierdan alguna función específica. Este tipo de métodos pueden incluirse dentro de la llamada Ingeniería Genética, y a los organismos obtenidos se les denomina Organismos Modificados Genéticamente (OMG) u Organismos Transgénicos.

Los animales transgénicos se definen como aquellos que han sido manipulados genéticamente, insertando un gen que no forma parte natural de su genoma (transgén), con la finalidad de que se incorpore de manera estable, para que pueda heredarse. Así, los animales transgénicos tienen la capacidad de producir proteínas que no están codificadas de manera natural en su genoma o bien se les inserta un gen con un promotor que permite expresar la proteína cuando no se lleva a cabo de manera natural.

Un ejemplo de ello es la generación de un salmón que sobreexpresa la hormona del crecimiento; de manera natural, el salmón deja de expresar la hormona del crecimiento en temperaturas frías y el transgénico nunca deja de hacerlo, de tal manera que en el mismo tiempo de desarrollo el salmón transgénico llega a crecer el doble o más que el silvestre. Por otro lado, la estrategia más efectiva para conocer la función de una proteína es eliminar su función biológica del organismo y analizar el efecto generado. Con este fin se crearon los animales transgénicos denominados knockout, en los cuales se altera el gen de una proteína particular con la finalidad de que no se exprese o que, al expresarse, se produzca una molécula no funcional.

Aplicaciones de los Animales Transgénicos

1. Modelos de enfermedad. Es posible introducir alteraciones en los genes de animales con la finalidad de provocar una enfermedad similar a la que se presenta en el ser humano. Estos modelos animales generados transgénicamente aportan grandes ventajas comparadas con los ensayos clínicos, ya que en los estudios con humanos resulta muy difícil el apego a tratamientos y a indicaciones médicas; sin embargo, en los modelos animales estas variables son controladas.
2. Mejora del ganado. La biotecnología ha alcanzado a los productores de alimento, los cuales, mediante técnicas de ingeniería genética, han modificado a los animales de cría de forma que tengan un crecimiento más rápido, desarrollen menos grasa, metabolicen los alimentos de forma más eficaz y resistan las enfermedades.
3. Producción de proteínas recombinantes. Los sistemas de producción de proteínas recombinantes deben tener la capacidad de producir grandes cantidades, biológicamente activas e idénticas a las endógenas. A pesar del bajo costo de producir proteínas recombinantes en bacterias y levaduras, estos microorganismos no realizan varias de las modificaciones postraduccionales requeridas para la correcta función in vivo de las proteínas de interés.

Creación de un Transgén

El ADN de un organismo contiene toda la información genética; es decir, es donde se encuentra la información para que se produzcan todos los ARN y las proteínas del organismo. Esta información está codificada en secuencias de nucleótidos llamadas genes, que están formados por dos regiones: la región promotora y la región codificante. La estructura del ADN es en esencia la misma en todos los organismos; pese a ello, puede haber grandes diferencias en el control de la expresión de los genes.

Por tanto, el término transgén se refiere a un gen que es insertado en un genoma o vector genético; generalmente, son genes manipulados por ingeniería genética, diseñados con las regiones promotoras y codificantes que son funcionales en la célula u organismo donde va a introducirse. Estos diseños pueden incluir combinaciones de ADN de diferentes especies, como por ejemplo un promotor viral y una región codificante proveniente de un humano; este transgén puede funcionar perfectamente en cualquier célula eucariota. Sin embargo, si se quiere producir una proteína eucariota en una célula procariota, debe diseñarse un transgén que contenga un promotor procariota y, además, debe modificarse la región codificante del gen eucariota para que el ARNm eucariota pueda traducirse en la célula procariota, ya que la secuencia de reconocimiento del codón de inicio es diferente en eucariotas que en procariotas. A los transgenes también se les ha llamado genes exógenos o foráneos.

Ratones Transgénicos: Modelos Experimentales

El ratón es el animal más utilizado en modelos experimentales de enfermedades, debido a su tamaño, fácil manejo, ciclo reproductivo corto y gran tamaño de camada. Después del hombre, el ratón es el mamífero más estudiado a nivel genético, por lo que se conocen miles de mutaciones y se cuenta con una gran cantidad de genotecas, sondas y anticuerpos. A la par de la secuenciación del genoma humano, se ha secuenciado el genoma del ratón, y muchos de los genes del ratón tienen su contraparte en los humanos; sin embargo, existen diferencias importantes en la estructura de los genes y la actividad de las proteínas que codifican.

Si estas variaciones se ponen en el contexto de las enfermedades hereditarias o adquiridas, donde el cambio de un solo nucleótido en un gen o la asociación de varios cambios en diferentes genes pueden causar enfermedades, generar un ratón transgénico o knockout es una herramienta importante para obtener fenotipos similares a los de las enfermedades humanas. Como ejemplo cabe citar la obesidad, en cuyo caso se identificó el gen de la leptina, gen ob (obeso), así como el del receptor de leptina, gen db; al eliminar estos genes en el ratón se produce el fenotipo de obesidad.

Por tanto, parte de las investigaciones biomédicas está dirigida a aumentar la disponibilidad de modelos animales de fácil manejo en el laboratorio, como es el caso del ratón, mediante la generación de animales knockout o transgénicos que sobreexpresan alguna proteína. Por ello, se han conformado iniciativas similares a las que secuenciaron el genoma humano, con la finalidad de establecer grandes bibliotecas de células embrionarias de ratón, que contienen mutaciones nulas para cada gen predicho en su genoma.

Técnicas para Identificar a un Animal Transgénico

En el proceso de generar un animal transgénico es de suma importancia saber que el gen de interés se ha incorporado al material genético del animal. Los avances tecnológico-científicos han permitido desarrollar un gran número de métodos para el estudio de la incorporación de secuencias de ADN en un genoma que no las contenía, así como tecnologías que permiten analizar el nivel de la expresión del transgén en el ARNm o de la proteína.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Este método sirve para la identificación del ADN del transgén mediante la amplificación de un fragmento de este. Su utilidad reside en que es una técnica rápida, sencilla y relativamente barata. El resultado exitoso de la técnica tiene que ver con el diseño minucioso de los iniciadores, o primers, que flanquean el fragmento que se va a amplificar, los cuales deben ser específicos para el transgén que se está analizando. Cabe señalar que los fragmentos amplificados deben visualizarse mediante la técnica de electroforesis en agarosa después de teñirse. Para este estudio generalmente se toma una muestra de tejido de la cola del ratón o una biopsia lo menos invasiva para el animal.

Clonación

Para entender el concepto de clonación en un laboratorio, pueden observarse dos ejemplos claros de clonación en la naturaleza:

• a) Clonación unicelular.
• b) Clonación de organismos multicelulares.

En el hígado de un adulto ocurre un fenómeno importante de regeneración después de recibir un daño agudo. Los hepatocitos son células totalmente diferenciadas (se encuentran en etapa G0 del ciclo celular), las cuales al recibir el estímulo para dividirse entran en la etapa G1 del ciclo celular y generan dos células hijas por cada hepatocito en división.

Clonación Humana

El desarrollo de tecnologías de clonación de organismos multicelulares ha llevado al hombre a imaginar hipótesis inspiradas en el deseo de mejorar la especie humana, como son: multiplicar individuos dotados de un gran ingenio, bellezas excepcionales, selección de individuos sanos e inmunes a enfermedades genéticas, posibilidad de selección del sexo, obtención de órganos para trasplantes y reproducción de familiares difuntos.

Clonación Animal

Como es conocido por todo el mundo, el objetivo principal de la clonación animal es económico: mejora de la productividad y calidad de la ganadería y la agricultura, así como producción de proteínas de interés médico mediante la multiplicación de animales transgénicos. Por mencionar algunos ejemplos, al encontrarse con un espécimen de alta calidad en un rebaño, lo lógico es que se quisiera tener el mismo ejemplar en grandes cantidades, pero por desgracia junto con las cualidades también se acarrean ciertas deficiencias.

Clonación de la Oveja Dolly

Para lograr clonar a la oveja Dolly se llevaron a cabo los siguientes pasos: se obtuvieron y cultivaron in vitro células de la glándula mamaria (la ubre) de una oveja adulta de raza Finn Dorset (oveja con cara blanca); estas células somáticas diferenciadas y en fase G0 del ciclo celular se fusionaron con óvulos a los que previamente se les había extraído el núcleo (óvulos anucleados), provenientes de una oveja de raza Scottish Blackface (con cara negra). A estos óvulos, a los cuales se les introdujo el material genético proveniente del núcleo de células mamarias, se les activó utilizando una leve descarga eléctrica, induciéndolas a dividirse. Cuando los embriones llegaron a poseer entre ocho y 16 células (estadio de mórula), se implantaron en el útero de otras ovejas Scottish Blackface. Transcurridos 148 días nació un cordero de 0.6 kg de peso, totalmente blanco, al cual posteriormente se le llamó Dolly.

Aplicaciones Clínicas de la Terapia Génica

El conocimiento de las bases genéticas de algunas enfermedades y la reciente secuenciación del genoma humano han abierto la posibilidad de esta estrategia terapéutica. Esto supone perspectivas para la curación de muchas enfermedades a las que se pretende combatir mediante los genes, como elementos curativos. Por ello, en este momento la terapia génica se ve como una nueva forma de medicina molecular aplicable a la mayoría de las enfermedades, no solo las monogénicas sino también las multifactoriales, en cuyo tratamiento puede ser útil la modificación de la expresión génica.

Terapia Génica contra el Cáncer

El cáncer es la enfermedad en la que se encuentran registrados la mayor cantidad de protocolos clínicos con terapia génica, entre los que se encuentran la estimulación del sistema inmune para combatir las células cancerígenas, la terapia suicida para inducir la muerte de las células tumorales, la suplementación de genes supresores de tumores y el bloqueo de oncogenes.

Entre los diferentes protocolos clínicos, destaca el empleo de oligonucleótidos antisentido o estrategias de silenciamiento contra una variedad de oncogenes.

Terapia Génica contra Agentes Infecciosos

Se enfoca en la transducción de genes que bloqueen o disminuyan la expresión de genes involucrados en la replicación del agente infeccioso, o bien que limiten o impidan su diseminación en el organismo infectado. Las estrategias se basan en la inhibición de proteínas indispensables para la replicación del microorganismo mediante estrategias antisentido, señuelos de ARN y ARN catalíticos (ribozimas), o bien en la estimulación específica del sistema inmune contra el agente infeccioso utilizando vacunas genéticas o linfocitos específicos del patógeno.

Ejemplos específicos de estas aplicaciones incluyen el uso de ribozimas multidiana para regiones conservadas del genoma del VIH-1, las cuales han demostrado una inhibición eficiente de la replicación viral.

Terapia Génica contra la Cirrosis Hepática

Las etiologías de la cirrosis hepática incluyen las hepatitis virales, el consumo crónico de alcohol, la esteatohepatitis, etc. El daño hepático crónico conlleva a los hepatocitos a apoptosis y también existe una transformación fenotípica de las células estelares hepáticas (CEH) a un tipo miofibroblástico, proliferativo y sintetizador de proteínas de matriz extracelular (MEC). Esto ocasiona que el parénquima se sustituya por proteínas de MEC, como colágena tipos I y IV.

Etiquetas: Animales Transgénicos, Biotecnología, Clonación, ingeniería genética, Medicina Molecular, Terapia Génica, Vectores Virales