Fundamentos de la Hibridación In Situ

La hibridación in situ se basa en la hibridación del ADN o ARN en tejidos o células sobre un soporte físico (como un portaobjetos) que permite su visualización. Según el marcaje empleado, se distingue entre FISH (fluorocromos), CISH o SISH (marcaje enzimático o colorimétrico).

Esta técnica no cuantifica ácidos nucleicos, sino que detecta su presencia y visualiza su posición en células, tejidos o cromosomas. Las principales dificultades son la obtención de muestras aptas y la adhesión al soporte de observación. Una vez resueltos estos obstáculos, se aplica el procedimiento general de hibridación adaptado al tipo de muestra.

Variantes de la FISH

La FISH es una variante de la ISH que utiliza sondas marcadas con fluorocromos, permitiendo visualizar los ácidos nucleicos hibridados mediante luz ultravioleta. Su aplicación más destacada es el estudio cromosómico: detecta presencia o ausencia de secuencias definidas, mutaciones y deleciones asociadas a enfermedades.

Tipos de sondas en FISH convencional:

• LSI (Locus específico): Detectan alteraciones estructurales como duplicaciones, deleciones y translocaciones.
• Centroméricas: Se unen a regiones centrales. Detectan principalmente anomalías numéricas.
• Subteloméricas: Verifican el acortamiento de telómeros y su efecto sobre genes adyacentes.
• Pintado cromosómico: Mezclas de sondas para una visión general de alteraciones estructurales y numéricas.

Técnicas derivadas de la FISH convencional

• FISH Multicolor: Se utilizan 24 sondas cromosómicas para secuencias específicas que hibridan todos los cromosomas de una misma metafase, para reconocer las 22 parejas homólogas y el par sexual. Se conoce como cariotipo de colores.
• FISH Multibandas: Estudio detallado de una pareja de cromosomas homólogos mediante sondas para cada una de sus regiones. Permite detectar inversiones y reorganizaciones intracromosómicas con gran precisión.

Protocolo de la técnica de FISH

1. Preparación de la muestra: Se obtiene y se trata la muestra biológica (ADN, ARN, células o tejidos). En hibridación en soporte sólido, el material se fija a una membrana o portaobjetos para hacerlo accesible.
2. Desnaturalización: Se separan las dos hebras de ADN (o estructuras de ARN) mediante calor o agentes químicos, obteniendo cadenas simples que puedan hibridar.
3. Hibridación: Se añade la sonda marcada, que se une específicamente a la secuencia diana complementaria por apareamiento de bases.
4. Lavados: Se eliminan sondas que no se han unido o lo han hecho de forma inespecífica, aumentando la especificidad del resultado.
5. Visualización (o detección): Se detecta la señal del marcador de la sonda (fluorescencia, color o radiactividad) para identificar si la secuencia diana está presente.

Aplicaciones y limitaciones de la FISH

• Aplicaciones y ventajas: Diagnóstico pediátrico y prenatal, diagnóstico preimplantacional y enfermedades oncohematológicas (detección y seguimiento de cánceres como la leucemia).
• Limitaciones: Técnica costosa que requiere equipamiento especializado y personal formado. Solo detecta alteraciones para las que existen sondas específicas. Las sondas son sensibles a cambios ambientales.

Hibridación Genómica Comparada (CGH) y Array-CGH

La Hibridación Genómica Comparada (CGH) permite escanear el genoma completo de un individuo, detectando ganancias o pérdidas de ADN de entre 5-20 Mb. Requiere tres muestras: ADN problema, ADN control y cromosomas en metafase con cariotipo normal (XY). El ADN problema se marca en verde y el control en rojo. Ambos compiten por hibridar con los cromosomas metafásicos teñidos con DAPI. Limitación: No detecta reordenamientos equilibrados como translocaciones, pues no alteran la cantidad de ADN.

Array-CGH (Micromatrices): Las micromatrices son soportes físicos con sondas fluorescentes fijadas para regiones cromosómicas conocidas e incluso mutaciones asociadas a enfermedades. Permiten realizar la CGH de forma mucho más rápida y automatizada, sin necesidad de cromosomas metafásicos. El código de colores es idéntico al de la CGH: verde (solo en problema), rojo (solo en control), amarillo (en ambas muestras). Los resultados se obtienen escaneando la micromatriz y procesando los datos informáticamente. Limitaciones: No detecta reordenamientos equilibrados ni poliploidías. Requiere mayor cantidad y calidad de ADN; suele ser necesaria una amplificación previa por PCR.

Técnicas de Transferencia (Blotting)

Las técnicas de blotting consisten en el traslado de ácidos nucleicos (o proteínas) desde un gel de electroforesis a una membrana sobre la que se trabaja con sondas. Según el material analizado: Southern blot (ADN), Northern blot (ARN) o Western blot (proteínas).

Southern y Northern Blot

• Southern Blot (ADN): 1º Digestión del ADN con enzimas de restricción; 2º Separación por electroforesis en gel; 3º Desnaturalización con HCl 0,2 N y NaOH 0,5 M; 4º Transferencia a membrana por capilaridad (15-20 h); 5º Fijación, hibridación con sondas y revelado.
• Northern Blot (ARN): Procedimiento prácticamente idéntico al Southern blot, pero con precauciones adicionales por la mayor fragilidad del ARN. Muy empleado en estudios de expresión génica.

Etiquetas: Biología Molecular, FISH, Genética, Hibridación in situ, Southern Blot