1. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica que permite obtener muchas copias de un fragmento concreto de ADN a partir de una cantidad mínima. Para realizarla se requieren los siguientes componentes: ADN molde, cebadores (primers), ADN polimerasa termoestable (como la Taq), dNTPs, magnesio y un tampón con agua estéril.

Fases del ciclo de PCR

• Desnaturalización: Separación de las dos hebras de ADN mediante alta temperatura.
• Hibridación: Unión de los primers a la secuencia complementaria.
• Extensión: La polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN.

Los primers son fundamentales, ya que determinan la especificidad al marcar el inicio y el final del fragmento. La Taq polimerasa resiste altas temperaturas, aunque carece de capacidad correctora, por lo que existen polimerasas de alta fidelidad.

Variantes de la PCR

• PCR a tiempo final: El resultado se observa al concluir, generalmente mediante electroforesis.
• Hot Start PCR: Evita amplificaciones inespecíficas.
• PCR múltiple: Amplifica varias secuencias simultáneamente.
• RT-PCR: Permite trabajar a partir de ARN.
• qPCR (Tiempo real): Utiliza fluorescencia para detectar y cuantificar el ADN en cada ciclo.

2. Sondas Moleculares

Las sondas son cadenas de nucleótidos complementarias a una secuencia diana, marcadas para identificar el híbrido formado. Pueden ser de ADN, ARN o análogos nucleicos.

Tipos de sondas según su origen

• Sondas obtenidas por PCR: Requieren conocer las secuencias que flanquean la región diana.
• Sondas de síntesis química: Monocatenarias, ideales para hibridación in situ por su pequeño tamaño, aunque con menor sensibilidad.
• Sondas de ADN recombinante: Obtenidas mediante clonación en vectores (plásmidos) y cultivo bacteriano.
• Sondas de análogos nucleicos: Sustituyen el esqueleto azúcar-fosfato por aminoetil-glicina. Son más estables, no tienen carga eléctrica y resisten la degradación por nucleasas.

Métodos de marcaje

1. Marcaje terminal: Uso de la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para añadir nucleótidos al extremo 3’.
2. Marcaje por PCR: Incorporación de dNTPs marcados durante la amplificación.
3. Marcaje de sondas de ARN: Mediante transcripción con ARN polimerasa.
4. Desplazamiento de mella (Nick translation): Uso de ADNasa I y ADN polimerasa I para marcar genomas enteros.
5. Cebado al azar (Random priming): Uso de hexámeros y el fragmento Klenow para sintetizar cadenas marcadas.

Nota: Tras el marcaje, es esencial la purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar nucleótidos libres y reducir el ruido de fondo.

3. Pretratamiento de Muestras

El pretratamiento es la fase previa a la extracción para optimizar el rendimiento de los ácidos nucleicos.

Procedimientos específicos

• Lisis de hematíes: Se elimina el sobrenadante (hemoglobina) y se conserva el sedimento (leucocitos).
• Células mononucleadas: Aislamiento mediante centrifugación en gradiente de densidad (polisucrosa).
• Cultivos celulares: En suspensión (centrifugación y lavado) o en monocapa (despegue mecánico o enzimático con tripsina).
• Tejidos frescos: Requieren homogeneización mecánica (mortero/nitrógeno líquido) o química (proteasas y detergentes).
• Tejidos fijados en formol/parafina: Requieren desparafinización previa con xilol antes de la digestión química.
• Otras muestras: Incluye el uso de tampones para bacterias, kits comerciales para mucosa oral y agentes mucolíticos (N-acetil-L-cisteína) para esputo.

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