1. Clonación de ADN: Proceso y Aplicaciones

Aislamiento del fragmento de ADN

Se realiza un lisado (ruptura) de las células que contienen el gen de interés y se extrae el ADN. Se aísla la porción de ADN en la que está el gen y se corta la cadena en puntos específicos, llamados sitios de restricción, mediante endonucleasas de restricción.

Formación del ADN recombinante

El ADN aislado se coloca en un vector, comúnmente un plásmido, empleando la misma enzima de restricción para abrirlo en un único sitio. Esto asegura que los extremos sean complementarios. A continuación, la adición de la enzima ADN ligasa, que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo fosfato 5′ y el grupo hidroxilo 3′, permite la unión de los segmentos. El plásmido recombinante debe incluir un gen marcador (resistencia a antibióticos, fluorescencia o marcadores enzimáticos) para su posterior identificación.

Transformación y selección bacteriana

• Transformación: Incorporación de los plásmidos en células hospedadoras (ej. E. coli) mediante un choque térmico.
• Selección: Las bacterias se cultivan en placas de Petri con medio de agar y antibiótico. Solo las bacterias transformadas, que poseen el gen de resistencia, sobrevivirán y formarán colonias.

Aislamiento final

Se obtienen millones de copias mediante lisis bacteriana y centrifugación diferencial. Esta técnica es fundamental en aplicaciones como la terapia génica, por ejemplo, para tratar la fibrosis quística.

2. El Sistema CRISPR: Defensa y Edición Genética

El genoma de bacterias y arqueas presenta secuencias repetidas, palindrómicas, cortas y agrupadas, conocidas como CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), separadas por secuencias espaciadoras. Estas secuencias son vestigios de ADN de virus (bacteriófagos) que actúan como un sistema defensivo natural.

Cerca de esta región residen genes que codifican proteínas como la Cas-9, una endonucleasa que actúa como tijera molecular. El proceso sigue estos pasos:

1. Adquisición: La bacteria captura fragmentos de ADN vírico y los incorpora al locus CRISPR.
2. Transcripción: Se forman ARN guías que contienen la secuencia espaciadora.
3. Interferencia: Si el virus reaparece, el ARN guía reconoce el ADN vírico y la Cas9 rompe la doble hélice, destruyéndolo.

3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica que permite obtener un alto número de copias de un fragmento de ADN mediante un termociclador. Los componentes necesarios son:

• ADN molde: El fragmento a amplificar.
• Taq polimerasa: ADN polimerasa termoestable.
• Cebadores (primers): Oligonucleótidos complementarios que flanquean el gen.
• dNTPs: Nucleótidos para la síntesis de ADN nuevo.

Etapas del ciclo de PCR

• Desnaturalización (95°C): Separación de las cadenas de ADN.
• Hibridación (55°C): Unión de los cebadores a las secuencias complementarias.
• Síntesis (72°C): La ADN polimerasa extiende las nuevas cadenas.

Este proceso es exponencial: tras 30 ciclos, se obtienen miles de millones de copias en menos de 90 minutos.

Estudios de expresión génica (RT-PCR)

A partir de ARN, se obtiene ADN mediante Transcripción Inversa (RT) y se amplifica. Esta prueba permite determinar si un gen específico se está expresando en las células analizadas.

Etiquetas: ADN recombinante, Biología Molecular, CRISPR, ingeniería genética, PCR