Conceptos Fundamentales de Proteínas y Técnicas Bioquímicas

Definiciones Clave en Proteómica

• Dominio proteico: Región estructural y funcionalmente independiente dentro de una proteína que puede plegarse de forma autónoma.
• Salting Out: Técnica que utiliza altas concentraciones de sal (como sulfato de amonio) para precipitar proteínas, disminuyendo su solubilidad.
• Cromatografía de afinidad: Técnica de purificación que separa proteínas según su unión específica a un ligando inmovilizado en una matriz.
• Modificación postraduccional proteica: Cambios químicos en proteínas tras su síntesis, como fosforilación o glicosilación, que afectan su función o destino celular.
• Western blot: Técnica para detectar proteínas específicas en una mezcla compleja mediante anticuerpos específicos tras separación por SDS-PAGE.
• Isoelectroenfoque: Método que separa proteínas según su punto isoeléctrico (pI) usando un gradiente de pH en un campo eléctrico.

Estabilidad y Precipitación Proteica

• Desnaturalización: Pérdida del plegamiento estructural sin necesariamente formar agregados insolubles.
• Precipitación: Formación de agregados insolubles que sedimentan o se separan del medio.
• Condiciones que inducen precipitación:
  • Alta concentración salina (salting out).
  • Cambio extremo de pH o temperatura.
• Mecanismo molecular: Se reduce la solvatación (interacción con el agua), lo que permite que las superficies hidrofóbicas de las proteínas se agreguen entre sí.
• Aplicación industrial: Precipitación con etanol para purificar albúmina en la industria farmacéutica.

Estructura y Conformación Proteica

• Estructura terciaria: Plegamiento completo de una cadena polipeptídica.
• Estructura cuaternaria: Asociación de múltiples cadenas polipeptídicas (subunidades).
• Fuerzas que estabilizan:
  • Puentes de hidrógeno
  • Interacciones hidrofóbicas
  • Enlaces disulfuro
  • Fuerzas electrostáticas (puentes salinos)
• Ejemplo de proteína fibrosa: Colágeno.

Técnicas para Determinar la Estructura 3D de Proteínas

• Cristalografía de Rayos X
  • Ventaja: Alta resolución atómica.
  • Desventaja: Requiere cristalizar la proteína.
• RMN (Resonancia Magnética Nuclear)
  • Ventaja: Permite estudio en solución.
  • Desventaja: Limitada a proteínas pequeñas (<40 kDa).
• Crio-Microscopía Electrónica (Cryo-EM)
  • Ventaja: Útil para grandes complejos.
  • Desventaja: Resolución menor que cristalografía (aunque ha mejorado).

Propiedades Biofísicas de las Proteínas

• Absorción de proteínas en el UV
  • Longitud de onda: ~280 nm.
  • Fundamento bioquímico: La absorción se debe a los anillos aromáticos de triptófano y tirosina, que absorben luz en esa región.
  • Utilidad experimental: Medir la concentración de proteínas en solución mediante espectrofotometría UV (ley de Beer-Lambert).

Extracción y Purificación de Proteínas

• Extracción de proteínas desde células
  • Técnicas de ruptura celular:
    • Homogeneización mecánica: Por ejemplo, con Potter o pistón de teflón.
    • Sonicación: Uso de ondas ultrasónicas para romper membranas.
    • Lisis química: Uso de detergentes como SDS o Triton X-100.
  • Componentes de la solución extractora:
    • Buffer de pH constante: Para evitar desnaturalización por cambios de pH.
    • Inhibidores de proteasas: Previenen degradación de proteínas.
    • Agentes reductores (como DTT o β-mercaptoetanol): Evitan formación de puentes disulfuro no deseados.
• Técnicas para eliminar sales o concentrar proteínas
  • Eliminar/reemplazar sales: Diálisis
    • Fundamento: Difusión de solutos pequeños (como sales) a través de una membrana semipermeable hacia un buffer sin sal.
  • Concentrar proteína: Ultrafiltración
    • Fundamento: Paso de solvente y solutos pequeños a través de una membrana con un tamaño de corte específico, reteniendo proteínas.

Conformación de Aminoácidos Adyacentes en Proteínas

• Conformación más común en grupos R adyacentes: En hoja beta plegada.
• Conformación predominante: Trans, porque minimiza el choque estérico entre los grupos R adyacentes.
• Excepciones:
  • Prolina: Puede estabilizar conformación cis, especialmente en giros o vueltas β.
  • Glicina: Por su flexibilidad, puede aparecer en regiones con conformaciones menos comunes (giros, bucles).
• Efectos:
  • La Prolina introduce rigidez y quiebres en la estructura.
  • La Glicina permite flexibilidad y giros cerrados.

Bioenergética y Metabolismo Celular

Conceptos Clave en Bioquímica

1. Fosforilación a nivel de sustrato: Es la síntesis directa de ATP (o GTP) a partir de un fosfato inorgánico y un nucleótido, usando la energía de un intermediario metabólico sin requerir una cadena transportadora de electrones.
   • Ejemplos:
     • Reacción de fosfoglicerato quinasa en la glicólisis.
     • Reacción de succinil-CoA sintetasa en el ciclo de Krebs.
2. ΔG° (Delta-G estándar): Es el cambio de energía libre bajo condiciones estándar (1 M, 25 °C, pH 7).
   • Uso: Permite predecir si una reacción es espontánea o requiere energía para proceder.
3. Cofactor enzimático: Molécula no proteica necesaria para la actividad de muchas enzimas. Puede ser un ion metálico o una coenzima.
   • Ejemplo: NAD⁺ en deshidrogenasas.
4. Tres categorías de reacciones enzimáticas:
   • Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de óxido-reducción.
   • Transferasas: Transfieren grupos funcionales entre moléculas.
   • Liasas: Rompen enlaces sin agua ni redox, formando dobles enlaces o anillos.
5. Regulación alostérica: Es cuando un modulador (activador o inhibidor) se une a un sitio distinto al activo, alterando la conformación de la enzima y su actividad. Permite respuesta rápida y reversible a señales celulares.
6. NAD⁺ (Coenzima: Nicotinamida Adenina Dinucleótido): Actúa como aceptor de electrones en reacciones de oxidación, transformándose en NADH. Es esencial en metabolismo energético.
7. Ecuación de Lineweaver-Burk: Es la forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten. Se obtiene al graficar 1/v contra 1/[S]; facilita la estimación de Km y Vmax.
8. Carbono anomérico: Es el carbono del grupo carbonilo (aldehído o cetona) que, al ciclarse un monosacárido, se convierte en un nuevo centro quiral (es el carbono 1 en aldosas, o 2 en cetosas).

Vías Metabólicas Centrales

1. Vía para producir poder reductor: Ruta de las Pentosas Fosfato
   • Tiene dos fases:
     • Fase oxidativa (produce NADPH):
       • Glucosa-6-fosfato → 6-fosfogluconolactona
       • 6-fosfogluconato → Ribulosa-5-fosfato + 2 NADPH + CO₂
     • Fase no oxidativa (intercambio de azúcares):
       • Ribulosa-5-fosfato → Ribosa-5-fosfato o → intermediarios de la glicólisis (gliceraldehído-3P, fructosa-6P)
   • Destinos de productos:
     • NADPH: Biosíntesis de ácidos grasos, detoxificación (glutatión).
     • Ribosa-5P: Síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos.
2. Modelos de interacción enzima-sustrato
   • Modelo llave-cerradura (descartado): Proponía que el sustrato encajaba perfectamente en el sitio activo. Se descartó porque no explica la especificidad dinámica ni los cambios conformacionales observados.
   • Modelo actual (ajuste inducido): La enzima cambia su conformación al unirse al sustrato, mejorando su afinidad y orientando grupos catalíticos.
3. Ciclo de Krebs como vía anfibólica
   • Significado: El ciclo de Krebs es anfibólico porque tiene funciones tanto catabólicas (oxidación de acetil-CoA para producir energía) como anabólicas (proporciona precursores para biosíntesis).
   • Ejemplos (excluyendo acetil-CoA):
     • α-Cetoglutarato: Precursor para síntesis de glutamato (→ aminoácidos, neurotransmisores).
     • Oxalacetato: Precursor para la gluconeogénesis o la síntesis de aspartato.
4. Efectos positivos de las enzimas
   • Aumentan la velocidad de reacción: Reducen la energía de activación → aceleran procesos hasta millones de veces.
   • Aumentan especificidad: Dirigen reacciones hacia productos útiles y evitan reacciones no deseadas.
   • Mecanismo molecular:
     • Formación de un complejo enzima-sustrato estabiliza el estado de transición.
     • Sitios activos orientan grupos funcionales y estabilizan cargas transitorias.
5. Rol de la fermentación en glicólisis: La fermentación regenera NAD⁺ a partir de NADH, permitiendo que la glicólisis continúe en ausencia de oxígeno.
   • Fermentación láctica:
     • Sustrato: Piruvato
     • Producto: Lactato
     • Organismos: Músculo humano, bacterias lácticas.
   • Fermentación alcohólica:
     • Sustrato: Piruvato
     • Productos: Etanol + CO₂
     • Organismos: Levaduras (Saccharomyces cerevisiae).
6. Roles de la glucosa y pregunta sobre fructosa
   • Tres roles de la glucosa:
     • Fuente primaria de energía (ATP por glicólisis).
     • Precursor de macromoléculas (nucleótidos, lípidos, aminoácidos).
     • Mantenimiento de niveles de NADPH (vía pentosas) y glicógeno.
   • ¿Se puede vivir solo con fructosa? No completamente. Aunque la fructosa puede convertirse en intermediarios glucolíticos en el hígado, muchas células (neuronas, eritrocitos) requieren glucosa directa para funcionar.
   • Fructosa 2,6-bifosfato:
     • Rol: Activa la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1), estimulando la glicólisis.
     • Enzima productora: PFK-2/FBPasa-2, regulada hormonalmente.
7. Productos netos de la glicólisis y ciclo de Krebs
   • Glicólisis (por glucosa):
     • 2 ATP (neto)
     • 2 NADH
     • 2 Piruvato
   • Ciclo de Krebs (por glucosa → 2 piruvatos):
     • 6 NADH
     • 2 FADH₂
     • 2 GTP (→ 2 ATP)
     • 4 CO₂
   • Procesos donde se obtienen:
     • NADH/FADH₂: Reacciones de oxidación (deshidrogenasas).
     • ATP/GTP: Fosforilación a nivel de sustrato.
     • CO₂: Descarboxilaciones oxidativas.
8. Glucosa desde lípidos: Gluconeogénesis desde propionato
   • Organismos (plantas, bacterias) pueden obtener glucosa desde lípidos a través del ciclo del glioxilato, no así los humanos.
   • Producto clave: Propionil-CoA → succinil-CoA → oxalacetato → glucosa (por gluconeogénesis).
   • Compartimentos:
     • β-oxidación: Mitocondria.
     • Gluconeogénesis: Mitocondria y citosol.
     • Ciclo del glioxilato (en glioxisomas en plantas).
9. ¿Por qué la gluconeogénesis no es el reverso de la glicólisis?
   • Razón: Tres pasos de la glicólisis son irreversibles (altamente exergónicos), por lo tanto, deben ser eludidos por pasos diferentes en gluconeogénesis.
   • Reacciones diferenciadoras:
     • Glucosa-6-fosfato → Glucosa (por glucosa-6-fosfatasa).
     • Fructosa-1,6-bisfosfato → Fructosa-6-fosfato (por FBPasa-1).
     • Piruvato → Fosfoenolpiruvato (por piruvato carboxilasa + PEP carboxiquinasa).
   • Compartimentos:
     • Glicólisis: Citosol.
     • Gluconeogénesis: Mitocondria (primeros pasos) y citosol.

Procesos Clave en Biología Celular y Molecular

Fotosíntesis y Respiración Celular

• ¿En qué consisten las etapas clara y oscura de la fotosíntesis?

  La fase luminosa (o clara) es la etapa de la fotosíntesis en la cual se genera energía (ATP) y poder reductor (NADPH) para luego, en la fase oscura (o ciclo de Calvin), aprovechar esto para fijar CO₂.

• ¿Qué es la fuerza protón motriz que se describe en la mitocondria para el proceso de fosforilación oxidativa? ¿Qué proteína/enzima aprovecha esta fuerza?

  Esto se le conoce como la gradiente quimiosmótica de protones, separada por la membrana, que genera un potencial de energía. Esta energía puede ser utilizada por la ATP sintasa para generar ATP.

• Ubiquinona: ¿Qué características tiene esta molécula, entre qué complejos actúa en la cadena transportadora de electrones, en qué organelo?

  Es una molécula hidrofóbica y liposoluble que participa en el paso de electrones desde el Complejo I/II al Complejo III en la mitocondria.

• ¿En qué consiste la beta-oxidación de lípidos? Indique sustratos y productos, así como dónde ocurre.

  Consiste en la oxidación de ácidos grasos (sustrato) a acetil-CoA y poder reductor (NADH y FADH₂). Ocurre en la mitocondria.

• ¿Qué se entiende por nitrificación? Indique sustratos y productos y si es que hay más de una etapa.

  Proceso de oxidación del NH₄⁺ en organismos como bacterias. Los sustratos son NH₄⁺ y nitrito, y los productos son el nitrito y nitrato. Sí, hay dos etapas principales: nitritación (NH₄⁺ a NO₂⁻) y nitratación (NO₂⁻ a NO₃⁻).

• ¿Qué le puede ocurrir a la clorofila en el Fotosistema II cuando recibe energía lumínica? Indique dos desenlaces posibles de los cuatro vistos en clase.

  Cuando la clorofila en el Fotosistema II recibe energía lumínica, puede ocurrir:

  • Fluorescencia: Emisión de luz a una longitud de onda mayor.
  • Transferencia de energía por resonancia: La energía se transfiere a una molécula adyacente.
  • Fotoquímica: La clorofila excitada cede un electrón, iniciando la cadena de transporte de electrones.
  • Disipación de calor: La energía se libera como calor.

  Los dos desenlaces posibles mencionados en el texto original son: la fluorescencia y la formación del radical libre mediante la entrega del electrón libre (lo que se refiere a la fotoquímica).

Preguntas Adicionales de Bioquímica

• ¿Cuál es la implicancia de que la enzima Rubisco utilice O₂ como sustrato?

  La enzima Rubisco (ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa) posee un sitio activo que no discrimina completamente entre moléculas de CO₂ y O₂, por lo que puede tener actividad carboxilasa y oxigenasa.

  • Al usar CO₂ como sustrato (actividad carboxilasa), se generan dos moléculas de 3-fosfoglicerato.
  • Al ocupar O₂ como sustrato (actividad oxigenasa), se genera solo una molécula de 3-fosfoglicerato y, además, una molécula de 2-fosfoglicolato. Este último debe ser transformado a 3-fosfoglicerato, lo cual implica gasto de energía y pérdida de CO₂ fijado, un proceso conocido como fotorrespiración.

• ¿Qué es el Complejo Nitrogenasa Bacteriano y qué requiere para funcionar?

  Es un complejo enzimático (compuesto por dinitrogenasa reductasa y dinitrogenasa) encargado de la fijación de N₂ atmosférico en bacterias. Requiere para su funcionamiento:

  • Gasto de ATP.
  • Transporte de electrones entre los distintos cofactores de ambas enzimas.
  • Condiciones anaeróbicas, ya que la nitrogenasa es muy sensible al oxígeno.

• ¿Cuáles son las principales diferencias entre la síntesis de bases púricas vs. pirimidínicas?

  • El anillo purínico se forma directamente sobre la ribosa-5-fosfato a partir de diversas moléculas (como aspartato, glicina, CO₂, formato, glutamina).
  • Las bases pirimidínicas se forman primero el anillo pirimidínico y, una vez formado, se une a la ribosa-5-fosfato.

• Explique cómo se vinculan el ciclo de la urea con el ciclo de Krebs y por qué es relevante en términos energéticos.

  Ambos ciclos están interconectados:

  • El fumarato liberado desde el ciclo de la urea en el citosol entra a la matriz mitocondrial en forma de malato y es incorporado al ciclo de Krebs.
  • Por otra parte, el oxalacetato formado en el ciclo de Krebs puede ser convertido a aspartato y salir al citosol, donde se condensa junto a citrulina para formar argininosuccinato en el ciclo de la urea.

  Importancia en términos energéticos: El malato, una vez transportado a la matriz, sirve para obtener poder reductor (NADH) que recupera parte del costo energético del ciclo de la urea, ya que el NADH puede entrar en la cadena de transporte de electrones para producir ATP.

• ¿Qué es el transporte cíclico de electrones (Cyt b6f)?

  Es una vía de producción de energía que involucra solo el Fotosistema I (PSI) y el complejo Citocromo b₆f. La clorofila del PSI es excitada y los electrones son transferidos a la plastoquinona (en vez de su aceptor final NADP⁺), que los lleva al complejo Citocromo b₆f. Este complejo bombea protones, contribuyendo a la generación de un gradiente de protones y al funcionamiento de la ATP sintasa. Luego, los electrones viajan a través de la plastocianina (PC) de vuelta al PSI. En este proceso solo se produce ATP, sin producción de NADPH ni liberación de O₂.

• Explique cómo funciona el Fotosistema II en presencia de luz.

  Cuando el Fotosistema II (PSII) capta un fotón, la energía es absorbida por los pigmentos fotosintéticos y transferida a la clorofila P680 del centro de reacción. Al recibir esta energía, la clorofila P680 pasa a un estado excitado (P680*). En este estado, P680* es un reductor fuerte y cede un electrón a un aceptor primario, dejando a la clorofila en su estado oxidado (P680⁺). Una vez oxidado, P680⁺ es un oxidante muy fuerte y es capaz de «robar» un electrón a una molécula de agua (proceso de fotólisis del agua), generando protones (H⁺) y oxígeno (O₂). Finalmente, los electrones del PSII (vía el aceptor primario) llegan a la plastoquinona, reduciéndola a plastoquinol (PQH₂), que transportará los electrones al complejo Citocromo b₆f.

• ¿Cuál es la principal función de la fotofosforilación cíclica en el cloroplasto?

  La principal función de la fotofosforilación cíclica es generar fuerza protón-motriz para la síntesis de ATP. En este proceso, no se genera NADPH ni se libera O₂.

• Indique los productos que se formarán del proceso total de β-oxidación del ácido esteárico (18 carbonos).

  El ácido esteárico tiene 18 carbonos. Para su β-oxidación completa:

  • Número de acetil-CoA = n/2 = 18/2 = 9 acetil-CoA.
  • Número de ciclos de β-oxidación = (n/2) – 1 = (18/2) – 1 = 9 – 1 = 8 ciclos.
  • Por cada ciclo se produce 1 NADH y 1 FADH₂.

  Por lo tanto, los productos netos son: 9 acetil-CoA, 8 NADH y 8 FADH₂.

Etiquetas: Biología Molecular, Bioquímica, Fotosintesis, metabolismo, proteinas