HEMOSTASIA

Proceso complejo dirigido a evitar la pérdida de sangre por hemorragias producidas por lesiones en las paredes de los vasos sanguíneos. Engloba la formación de un coágulo para taponar el daño vascular y detener la hemorragia, la reparación del vaso y la disolución del coágulo. Se activa cuando se daña el endotelio vascular,lo cual pone en marcha varios procesos encadenados:

TROMBOPOYESIS:

es el proceso de producción de plaquetas en la MO.
– Recuento normal de plaquetas en SP: 150-400 x103 / 
– Vida media de las plaquetas : 7-10 días.
– La trombopoyesis mantiene la renovación continua de las plaquetas.
– Es una parte de la hematopoyesis: última célula progenitora unipotente plaquetaria:
CFU-MEG
– Esta regulada por la trombopoyetina que se sintetiza en el hígado y los riñones.

CÉLULAS PRECURSORAS

A diferencia de las series roja y blanca, en el compartimiento de células precursoras de la serie plaquetaria hay diferenciación y maduración celular ,pero no proliferación. Las células precursoras en las que se produce síntesis de ADN experimentan divisiones nucleares,pero el citoplasma no se divide,por lo que se originan células poliploides de gran tamaño,multinucleadas o con núcleos multilobulados. La primera célula precursora de esta serie es el megacarioblasto que deriva directamente de la CFU-MEG.

LAS PLAQUETAS:

son fragmentos citoplasmáticos anucleados,desprendidos del borde de los megacariocitos maduros localizados en la médula ósea,muy ricos en organelas y gránulos de secreción.

Membrana de la plaqueta:

  modelo mosaico fluido que contiene:

– Fosfolípidos:

tras la activación de las plaquetas se produce un reordenamiento de la bicapa lipídica aportando la carga – necesaria para el desarrollo de la hemostasia secundaria. 

– Glicoproteínas:

actúan como receptores que posibilitan la adhesión de las plaquetas con la matriz extracelular subendotelial,con otras plaquetas y con otras células. El conjunto de estas glicoproteínas se denomina glicocálix.

Citoplasma de la plaqueta:

es muy rico en estructuras y organelas, algunas de las cuales son específicas de la plaqueta y están relacionadas con su funcionalidad. Se pueden identificar varios sistemas: citoesqueleto y sistema contráctil,canicular,granular y otros…

SISTEMA GRANULAR:

Está formado por 2 tipos de granulaciones:

– Gránulos alfa:

contienen gran diversidad de proteínas,tanto de síntesis ( factor plaquetario 4 ,factor de crecimiento derivado de plaquetas, fibronectina, trombospondinas), como absorbidas del plasma sanguíneo ( factor von Willebrand, fibrinógeno,favor V). Tras la activación de la plaqueta ,la memb de estos gránulos se funde con las membranas del sistema canalicular abierto,liberando su contenido al interior del sistema para que sea secretado al exterior.

– Gránulos densos:

contiene una elevada proporción de Ca ( x eso son electrodensos) además de Mg, ADP, ATP, serotonina, epinefrina,etc..Tras la activación plaquetaria, migran a la periferia y se funden con la membrana de la plaqueta, liberando su contenido directamente al exterior.

HEMOSTASIA PRIMARIA

Se conoce como hemostasia primaria el conjunto de mecanismos que toman parte en la formación de un trombo plaquetario cuando se pierde la integridad vascular. Ante una lesión vascular,se produce rápidamente una vasoconstricción para limitar el flujo sanguíneo en el área de la lesión e inmediatamente se desencadena una secuencia de procesos que tienen como protagonista a la plaqueta: adhesión,activación y agregación.

1.ADHESIÓN PLAQUETARIA

Las plaquetas circulantes en reposo no presentan adherencia a las células endoteliales que tapizan los vasos, aunque portan en su membrana glicoproteínas, receptoras de moléculas de matriz extracelular, como la glicoproteína Ib. Cuando se produce una solución de continuidad en el endotelio vascular, es decir, una lesión vascular, la lámina basal y el tejido conectivo subendotelial quedan expuestos a todos los componentes sanguíneos y por tanto las plaquetas.
Este tejido conectivo está compuesto mayoritariamente por colágeno y otras proteínas de matriz extracelular, como fibronectina, laminina, y vitronectina , a las que se van a unir las plaquetas a través de las glicoproteínas receptoras de membrana.
La adhesión principal de las plaquetas es al colágeno, y para que se produzca se requiere la mediación del factor von Willebrand (FvW), presente también en el tejido subendotelial. El FvW actúa como puente de uníón entre el complejo glicoproteico Ib-IX-V de la membrana plaquetaria y las fibras de colágeno subendotelial. En esta fase de la hemostasia 1º,las plaquetas se adhieren y tapizan la superficie dañada para detener la hemorragia.

2.ACTIVACIÓN PLAQUETARIA

La interacción de los receptores de la membrana plaquetaria con sus ligandos en el tejido subendotelial en general y con el colágeno en particular, provoca la activación de la plaqueta,desencadenando varios procesos morfológicos y funcionales. La activación está regulada por cambios en los niveles citoplasmáticos de nucleótidos cíclicos,flujos de Ca, hidrólisis de fosfolípidos y fosforilación de enzimas.
En concreto,una vía principal de activación plaquetaria implica la hidrólisis de fosfolípidos de membrana por las fosfolipasas A2 y C,con la liberación de ácido araquidónico. Este ácido se transforma en endoperóxidos cíclicos por acción de una ciclo oxigenasa y finalmente en tromboxano A2 ( TXA2) gracias a una tromboxano sintetasa)
El TXA2 tiene múltiples funciones,puesto que ejerce una acción vasoconstrictora,estimula la movilización de calcio intracitoplasmática y es un potente agonista de receptores activadores de la plaqueta. El resultado final se concreta en 4 efectos:

1.Cambio de morfología

La primera manifestación de la activación plaquetaria es un cambio físico ,debido a una redistribución de los microtúbulos periféricos y de las proteínas del citoesqueleto. De esta forma,la plaqueta pierde su forma de disco biconvexo y adquiere una forma espiculada por emisión de pseudópodos.

2.Degranulación

La activación plaquetaria provoca la secreción al medio externo del contenido de los gránulos intracelulares.

3.Exposición de receptores de superficie para proteínas plasmáticas

El principal receptor que se expresa en la superficie externa de la membrana es el complejo glicoproteico IIb/IIa que se une a fibrinógeno y FvW.

4.Modificación de la estructura lipídica de la membrana plaquetaria

Los fosfolípidos con carga negativa quedan expuestos,lo cual acelera la coagulación plasmática.

SECRECIÓN DE SUSTANCIAS ACTIVAS

Las sustancias liberadas por este fenómeno de degranulación son muy diversas y tienen múltiples funciones:

– Desencadenar la agregación plaquetaria

Varias sustancias secretadas por la plaqueta tras su activación atraen mas plaquetas y potencian su agregación. Este es el caso , por ej: ADP, la adrenalina,la serotonina y el tromboxano A2
– Aumento de la vasoconstricción por ej:  la serotonina.

– Reparación y regeneración tisular:

la plaqueta activada libera diferentes factores de crecimiento. •

– Participación en la coagulación plasmática:

las plaquetas liberan también moléculas y factores que intervienen en la hemostasia secundaria: 
-El factor plaquetario 3 (f3p): necesario para iniciar la vía intrínseca de coagulación.
-El fibrinógeno o factor I. 
-El factor V. 
-El factor XIII o estabilizante de la fibrina.
-El FvW, fundamental en la adhesión plaquetaria e imprescindible para el mantenimiento plasmático del factor VIII coagulante. 

3. AGREGACIÓN PLAQUETARIA

La agregación plaquetaria es un fenómeno por el que las plaquetas se unen entre sí,formando un entramado abigarrado que se conoce como trombo plaquetario. La uníón entre las plaquetas se realiza gracias al fibrinógeno ( el plasmático y el liberado por la propia plaqueta) ,que se une a los complejos glicoproteínas IIb/IIa de las membranas plaquetarias,sirviendo de puente entre plaquetas contiguas.

MOLÉCULAS REGULADORAS DE LA AGREGACIÓN PLAQUETARIA
ACTIVADORES:
fomentan la agregación, retroalimentando y amplificando el proceso.

-ADP:

induce la expresión de GPIIb/IIIa, facilitando la uníón al fibrinógeno. 

-Tromboxano A2:

induce movilización del Ca2+ intracelular.

– Adrenalina. Serotonina. Trombina. 
INHIBIDORES:

Producidas por el endotelio vascular, destinadas a evitar la agregación plaquetaria intravascular espontánea. Prostaciclina. 

PATOLOGÍAS ASOCIADAS A LA HEMOSTASIA PRIMARIA

Todas las alteraciones de las plaquetas se asocian con trastornos de la coagulación que pueden inducir a hemorragias producidas por:
• Imposibilidad de formar el trombo plaquetario.
• Inadecuada activación de la coagulación sanguínea.
• Déficit o alteración del Factor von Willebrand (FvW) 

– Síntomas clínicos indicadores de insuficiencia hemostasia primaria:

petequias, epistaxis, sangrado gastrointestinal, menorragia, etc. 

1.TROMBOPENIA:

disminución del nº de plaquetas en SP x  de los normales ( <130 x 10 plaquetas/uL). Puede ser debida a una producción insuficiente de plaquetas en la médula ósea/ a un incremento en su destrucción.
– PRODUCCIÓN INSUFICIENTE DE PLAQUETAS
La producción insuficiente de plaquetas puede responder a una disminución de la trombopoyesis / a una trombopoyesis ineficaz. En ocasiones se debe a trastornos congénitos ,como la enfermedad de May-Hegglin,pero también se observa en aplasia medular, síndromes mielodisplásicos y déficit de ácido fólico/ vit B12. La utilización de ciertos fármacos ,como los usados en quimioterapias,puede tmb disminuir la producción de plaquetas en la MO.

– INCREMENTO DE LA DESTRUCCIÓN DE PLAQUETAS
La destrucción aumentada de plaquetas puede deberse a varias causas:

-Hiperesplenismo.

el aumento de la destrucción de plaquetas se asocia con el secuestro de las mismas por el bazo hiperfuncionante.

-Púrpura trombocitopenia idiopática(PTI)

  La destrucción de plaquetas tiene causa inmunológica mediada por anticuerpos inmunotrombopenia. El término idiopática hace referencia al desconocimiento de lo que se origina la presencia de los anticuerpos.
Se conoce una forma aguda y autolimitada en la infancia asociada con infecciones víricas. Algunos anticuerpos dirigidos contra antígenos víricos dan reacción cruzada con antígenos, situados en la superficie de las plaquetas, disminuyendo su vida media.
Pero la forma más importante de la enfermedad es la PTI de la edad adulta, que cursa de forma crónica y es producida por auto anticuerpos, dirigidos contra la plaqueta, que determinan una reducción de la vida media de las plaquetas circulantes, causando diátesis hemorrágica, predisposición a las hemorragias y esplenomegalia.
Una manifestación de la diátesis hemorrágica es la presencia de pequeñas hemorragias en la piel, lo que se conoce con el nombre de púrpura.

-Púrpura trombocitopenia trombótica (PTT)

se debe a la presencia de un factor que induce la agregación plaquetaria en el plasma. Esto determina la formación de pequeños trombos que obstruyen la luz de los capilares, dando lugar a lesiones isquémicas( riñones y el SNC) y anemia hemolítica microangiopática.

-Trombocitopenia inducida por medicamentos. Es una destrucción de plaquetas mediada por AC producidos contra el medicamento y que son capaces de afectar a las plaquetas. La mejor conocida es la trombocitopenia inducida por heparina HIT, en la que el IgG dirigidas contra el complejo heparina-factor plaquetario 4, son capaces de unirse a las plaquetas a través de receptores de regiones FC y activarlas dando lugar a fenómenos trombóticos.
2. TROMBOCITOSIS:
La trombocitosis o trombocitemia es una alteración que consiste en el aumento del número de plaquetas en sangre periférica por encima de los valores normales. Este hallazgo suele ser accidental y la determinación de la causa genera un reto diagnóstico. Según la etiología, puede ser:
-Primaria, consecuencia del síndrome de mieloproliferativos. Trombocitemia esencial.
-Secundaria/ reactiva  las plaquetas aumentan el nº como reacción a otros procesos patológicos.
Trombocitopenia esencial (TE)

Es un síndrome mieloproliferativo que se caracteriza por trombocitosis mantenida en SP e hiperplasia de megacariocitos en médula ósea. Se debe a la expansión clonal de un precursor hematopoyético en la M.O, que afecta la proliferación de las 3series celulares,con importancia en la serie megacariocítica. Los pacientes con este síndrome presentan recuentos plaquetarios aumentados, en algunos casos, incluso superiores a 10. A pesar del elevado nº de plaquetas, están suelen ser disfuncionales, por lo que las manifestaciones clínicas pueden ser tanto hemorrágicas como trombóticas. Se han descrito varias mutaciones adquiridas implicadas en la aparición de TE, que afectan al receptor de la trombopoyetina (MPL), a la enzima tirosina quinasa y a la proteína chaperona Calreticulina(CA

Trombocitosis secundaria reactiva
La trombocitosis reactiva consiste en el aumento de plaquetas, como reacción a procesos inflamatorios, infecciosos, neoplásicos o de estrés agudo, que generan niveles elevados de trombo boletina, interleucina 6 y catecolaminas , responsables de la producción aumentada de plaquetas. Algunos medicamentos pueden provocar también un aumento de plaquetas.
3. ALTERACIONES FUNCIONALES : TROMBOPATÍAS 

– Síndrome de Bernard-Soulier:

es un trastorno hereditario autosómico, recesivo que afecta al gen  que codifica para la glicoproteína Ib, receptor del FvW. La ausencia /el mal funcionamiento de este receptor, hace que las plaquetas no se adhieran bien a la pared de los vasos lesionados con lo que impiden la formación de un coágulo normal.

– Trombastenia de Glanzmann:

es un trastorno genético que afecta a los genes que codifica para las glicoproteínas IIb/ IIa, que forman un complejo receptor del fibrinógeno. La ausencia / el mal funcionamiento de este complejo impide la correcta agregación plaquetaria mediada por fibrinógeno en el sitio de la lesión vascular ,impidiendo la formación de un trombo plaquetario normal.

– Deficiencias de almacenamiento del pool plaquetario.

Incluyen un conjunto de trastornos relacionados con los gránulos intracelulares y las sustancias que contienen. 3  categorías:

– Deficiencias del mecanismos secretor/ de liberación:

tanto los gránulos alfa como los gránulos densos están presentes ; su contenido es normal pero no se libera adecuadamente al torrente sanguíneo.

– Ausencia de gránulos densos:

implica la ausencia de las sust.Que se almacenan en ellos,fundamentales para una correcta activación de la plaqueta y para aumentar la vasoconstricción del vaso lesionado.

– Ausencia de gránulos alfa/ síndrome de plaquetas grises.

implica la ausencia de las sustancias que se almacenan en ellos, necesarias para la agregación, la reparación de la lesión y la correcta coagulación sanguínea.

– Trombopatías hereditarias enzimáticas.

afectan a enzimas que participan en las rutas metabólicas de activación de la plaqueta ,como la ciclooxigenasa y la tromboxano-sintetasa.
4. ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND (EvW)

El déficit cuantitativo o cualitativo de factor von Willebrand (FvW) se conoce con el nombre genérico de enfermedad de von Willebrand (EvW). El FvW es una glicoproteína multimérica que se sintetiza en las células endoteliales y en los megacariocitos. Está presente en el plasma sanguíneo, en el tejido subendotelial, en los gránulos a de las plaquetas y en las células endoteliales. Tiene varias funciones relacionadas con la coagulación:
– Sus multímeros contienen dominios de uníón al colágeno del tejido subendotelial y a regiones de uníón al complejo glicoproteico Ib/IX/V, lo que facilita la adhesión de las plaquetas en las zonas de lesión vascular. Los multímeros de > peso molecular son los que presentan mayor actividad adhesiva.
– Contiene también sitios de uníón al complejo Ilb/Illa, facilitando la agregación plaquetaria.
– Se une al factor VIII plasmático, protegíéndolo de la proteolisis.
La EvW es la enfermedad hemorrágica hereditaria más común (1% de la población), aunque la mayor parte de los pacientes solo presentan síntomas muy leves. Provoca una sintomatología similar a la observada en disfunciones plaquetarias y en hemofilias (déficit de factor VIII).

La EvW puede ser de tres tipos:

Tipo 1

Es un déficit cuantitativo parcial de FvW (niveles de FvW inferiores a los normales). Es el tipo más común y los síntomas suelen ser leves.

Tipo 2

Es una alteración funcional del FvW debido a un defecto estructural. Al no funcionar correctamente, la actividad es menor a la normal. Hay varios subtipos dependiendo de la función afectada:

Tipo 3

Es un déficit cuantitativo total o prácticamente total del FvW. Es la forma más grave de la enfermedad.
VALORACIÓN DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA
Parámetros incluidos en el hemograma
– Un recuento de plaquetas por debajo de los valores normales es indicativo de trombopenia y un recuento por encima de los valores de referencia es indicativo de trombocitosis.
– El volumen plaquetario medio (VPM) da idea del tamaño de las plaquetas.
-Un VPM por debajo de los valores normales señala la presencia de plaquetas pequeñas en la sangre o microtrombocitosis, que puede ser debida a un exceso de plaquetas viejas (de menor tamaño) o compatible con algunas enfermedades con base genética, como el síndrome de Wiskott-Aldrich.
-Un VPM por encima de los valores normales señala la presencia de plaquetas gigantes o megatrombocitosis. Actualmente se admite que es un indicador de reactividad plaquetaria, ya que se ha observado correlación con los estados de agregación plaquetaria, síntesis de tromboxano, función procoagulante y expresión de moléculas de adhesión.

FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA

– En el caso del plaquetocrito (PCT), su elevación o disminución respecto de los valores normales suele estar en relación con el número de plaquetas y el VPM.

– El índice de dispersión o distribución de plaquetas (IDP) informa sobre la mayor o menor homogeneidad en el tamaño de las plaquetas.Valores por encima del 65% indican la presencia de anisocitosis plaquetaria, es decir, un elevado grado de variación en el tamaño de las plaquetas. Se observa, por ejemplo, en casos de ausencia de bazo, mielodisplasias y PTT.
– Confirmar situaciones de trombocitosis y trombopenia.
– Diferenciar la trombopenia de la pseudotrombopenia. La pseudotrombopenia se debe a la agregación in vitro de las plaquetas (en el tubo en el que se ha extraído la muestra de sangre periférica). Cuando esto ocurre, el contador hematológico cuenta los agregados plaquetarios como una sola plaqueta/ incluso puede considerarlos como hematíes pequeños o restos de hematíes, de forma que el recuento de plaquetas arroja un valor inferior al real.
Ante un valor bajo en el recuento automatizado, el examen del frotis sanguíneo permite detectar la presencia de agregados plaquetarios, lo cual indica que se trata de una pseudotrombopenia y no de una trombopenia. Una posible causa de esta agregación in vitro es la presencia en la sangre de aglutininas contra las plaquetas dependientes de EDTA, que es el anticoagulante utilizado en muestras para hemograma. Para confirmar esta causa, una vez detectada la pseudotrombopenia en el frotis se puede realizar una triple extracción con EDTA, citrato sódico y heparina. El recuento de plaquetas y el examen de los frotis de las tres muestras permitirán distinguir si la agregación sólo se produce en el tubo con EDTA.
– Confirmar la presencia de microtrombocitos,macrotrombocitos y anisocitosis plaquetaria.

– Detectar la presencia de plaquetas reticuladas.Son las formas más jóvenes de las plaquetas circulantes, y tienen un tamaño mayor que las plaquetas envejecidas. Contienen restos de ARN, lo que les confiere su aspecto reticulado y son hemostáticamente más activas, al expresar más receptores glucoproteicos lb y IIb/Illa. La observación de un número elevado de plaquetas reticuladas en el frotis puede justificar un VPM alto. Se ha detectado en la trombocitopenia inmune crónica y en casos de recuperación hematopoyética precoz.
– Observar hipogranulación plaquetaria, es decir, plaquetas con un citoplasma grisáceo pobre en gránulos. Se puede detectar en PTI y en TE.

Examen microscópico de la médula ósea

El examen microscópico de la médula ósea está indicado cuando se sospecha la presencia de patologías de la hemostasia primaria asociadas a anomalías de la hematopoyesis.

– Trombopenias por producción insuficiente de plaquetas

En muchos casos, el estudio de la M.O permite identificar la causa de estas trombopenias: aplasia medular, hipoplasia medular amegacariocítica (celularidad escasa con ausencia de megacariocitos), síndrome mielodisplásico, etc.

– Trombopenias por destrucción periférica

En estas trombopenias la M.O presenta un aumento en la proporción de megacariocitos (para sustituir las plaquetas que se están destruyendo en otra zona del organismo, en un intento de mantener los niveles).

– Trombocitemia esencial

La M.O se caracteriza por hiperplasia megacariocítica, con ausencia de fibrosis colágena.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO EN HEMOSTASIA 1º

pruebas de funcionalismo plaquetar : 
-tiempo de hemorragia 
-tests de función plaquetaria ( PFA-100)
-agregación plaquetaria

6.5.2. Valoración global de la hemostasia primaria

La hemostasia primaria se puede valorar de manera global mediante pruebas inespecíficas in vivo e in vitro, de manera que un resultado anómalo alerta sobre una alteración, pero sin especificar la posible causa.
Tiempo de sangría o tiempo de hemorragia es el tiempo que tarda en cesar el sangrado que se produce al practicar una incisión cutánea de unas carácterísticas determinadas. Se utiliza para evaluar la hemostasia primaria en sus dos vertientes: vascular (vasoconstricción) y plaquetario (formación del trombo plaquetario). Suele solicitarse como prueba preoperatoria, para comprobar que hay una respuesta adecuada a la lesión vascular antes de una cirugía.
Para estandarizar la incisión se suelen utilizar dispositivos automáticos que disparan lancetas o cuchillas retráctiles de dimensiones concretas. A pesar de ello, la reproducibilidad de la prueba es baja, como también lo son su sensibilidad y su especificidad, ya que influyen en ella variables como la experiencia de la persona que realiza la prueba, el patrón vascular del paciente, el grosor de la piel, etc.
Hay dos modalidades: el método de lvy y el método de Duke.

Método de Ivy:

Es el más utilizado y el mejor estandarizado. Para su ejecución se siguen estos pasos:
1.Colocar un manguito de presión arterial (esfigmomanómetro) alrededor del brazo del paciente e inflarlo a 40 mm de Hg. Esta presión se mantiene durante toda la prueba.
2. Seleccionar la regíón dorsal del antebrazo en la que se va a practicar la incisión y desinfectarla. Se deben evitar venas superficiales, cicatrices y hematomas.
3. Colocar el dispositivo automático (tipo Simplate,x ej) sobre la piel del brazo sin presionar y apretar el disparador; al mismo tiempo, poner en marcha un cronómetro.

Las carácterísticas de la incisión dependen del dispositivo utilizado. Pueden ser 1/2 incisiones, de 5 mm de longitud x 1 mm de profundidad/de 10 mm de longitudX1 mm de profundidad. En cualquier caso, la incisión se realiza en dirección paralela a la longitud del brazo (las incisiones perpendiculares sangran + tiempo).
4. Retirar el flujo de sangre cada 30 segundos, acercando un papel de filtro de 1 mm de grosor a la incisión, sin tocar el borde y sin arrastrar.
5. Detener el cronómetro cuando cese el sangrado. El tiempo normal de sangría depende del dispositivo, pero habitualmente es inferior a 11 minutos.
El TS se alarga en pacientes con trombocitopenia, EvW, trombastenia de Glanzmann, síndrome de Bernard-Soulier, enfermedad del pool de almacenamiento y otros trastornos plaquetarios.
Puede alargarse también en pacientes con deficiencia de fibrinógeno o de factor V y en pacientes con trastornos vasculares. Igualmente, algunos fármacos (en particular los antiagregantes, como el ácido acetil salicílico [AAS]) producen alteración del TS.

Método de Duke

La incisión consiste en un pinchazo realizado con aguja o lanceta, de 3-4 mm de profundidad, en la yema del dedo o en el lóbulo de la oreja. Con esta metodología el TS suele ser inferior a cinco minutos.

Tiempo de obturación

Es un método in vitro para el estudio global de la hemostasia primaria.Es alternativo al TS, con > reproducibilidad y no cruento,x lo q está desplazando al TS en muchos laboratorios de hematología.
Se realiza en un aparato denominado analizador de función plaquetaria (PFA, de la terminología inglesa), que utiliza cartuchos desechables en los que se simula la hemostasia primaria en condiciones similares a las fisiológicas.

El cartucho posee un contenedor en el que se deposita sangre total citratada, la cual es aspirada por un capilar hacia una membrana recubierta de agonistas plaquetarios que tiene un orificio central de 150 um de diámetro.
La alta presión negativa a la que es sometido el flujo sanguíneo en la aspiración por el capilar hace que la sangre impacte contra la membrana con un elevado coeficiente de cizalladura, simulando el flujo arteriolar. El orificio actúa como una lesión en la pared vascular. Se suelen utilizar dos tipos de cartuchos, que difieren en la pareja de agonistas que recubren la membrana: colágeno/epinefrina (COL/EPI) o bien colágeno/ADP (COL/ADP).
Una vez iniciado el test, las plaquetas de la muestra entran en contacto con los agonistas de la membrana y experimentan los fenómenos típicos de la hemostasia primaria (adhesión, activación y agregación), desencadenando la formación de un trombo plaquetario que tapona rápidamente el orificio de la membrana e impide el flujo sanguíneo a través de él.
El PFA mide, exactamente, el tiempo que tarda en obturar el orificio de la membrana. Si se usan cartuchos COL/ADP, el tiempo de obturación normal suele ser inferior a 120 segundos; con los cartuchos COL/EPI, inferior a 175 segundos. Tiempos de obturación alargados indican defectos funcionales en las plaquetas, EvW o presencia de medicamentos inhibidores de la agregación plaquetaria, como AAS.
El uso simultáneo de los dos cartuchos mencionados permite precisamente descartar o confirmar este último supuesto, puesto que los medicamentos basados en AAS alargan el tiempo de obturación del cartucho COL/EPI pero no el del COL/ADP.

Retracción del coágulo

Otra prueba que ofrece información indirecta relativa a la cantidad de plaquetas y a la función plaquetaria es la retracción del coágulo. Este fenómeno se produce al final del proceso de formación del coágulo sanguíneo y es debido a la contracción de las fibras de trombostenina intraplaquetarias. La prueba se fundamenta en el hecho de que cuando el coágulo se retrae, se exprime el suero. La cantidad de suero producida está en relación con el grado de retracción del coágulo.
El procedimiento se realiza de la siguiente manera:
1. Introducir 1 ml de sangre en un tubo de ensayo de vidrio limpio (75 mm x 10 mm) y colocarlo baño a 37 C durante una hora.
2. Transcurrido el periodo de incubación, medir la distancia desde la base del tubo hasta el menisco superior de la sangre coagulada (altura total).
3. Retirar con cuidado el coágulo con un palillo fino o un alambre, dejando el suero que ha rezumado en el tubo (evitar exprimir adicionalmente el coágulo al retirarlo).
4. Medir la distancia desde la base del tubo hasta el menisco del suero (altura del suero).
5. Calcular el porcentaje que representa la altura del suero respecto de la total.
En condiciones normales, el suero que queda en el tubo representa alrededor del 40% del total o incluso un porcentaje superior. En la trombastenia de Glanzmann se obtienen porcentajes de suero claramente inferiores a los normales.

6.5.3. Agregometría

La agregometría o estudio de la agregación plaquetaria in vitro es la técnica específica de referencia para analizar la función plaquetaria. Los estudios de agregación plaquetaria se realizan en un aparato llamado agregómetro y permiten identificar y diagnosticar alteraciones funcionales de las plaquetas. La metodología clásica se basa en turbidimetría (agregometría de luz transmitida), mientras que recientemente se han desarrollado agregómetros basados en la impedancia eléctrica (agregometría de impedancia).
Los pacientes que se van a someter a una prueba de agregación plaquetaria deben suprimir la ingesta de medicamentos antiagregantes o que puedan interferir en la función plaquetaria, salvo que el estudio se realice para investigar el efecto de esta medicación.

Agregometría de luz transmitida

La agregometría de luz transmitida es metodología clásica+ utilizada para analizar la agregación plaquetaria. La prueba se realiza sobre plasma rico en plaquetas (PRP) obtenido a partir de sangre citratada. La presencia de quilomicrones puede interferir en la medición,xq la sangre se debe extraer en ayunas.
Para calibrar el agregómetro, se requiere también plasma pobre en plaquetas (PPP) del mismo paciente, obtenido por centrifugación intensa (1.500 g) de la sangre citratada.

Fundamento

La agregometría de luz transmitida es una prueba turbidimétrica que se fundamenta en la variación que experimenta la densidad óptica del PRP durante la realización de la prueba.
El agregómetro de luz transmitida consta de una fuente de luz, una cubeta desechable en la que se mantiene la muestra (PRP) en agitación y un detector.

El PRP es un líquido turbio homogéneo que tiene una determinada densidad óptica. Al añadirle un agonista se induce la agregación de las plaquetas. La formación de agregados, cada vez de mayor tamaño, determina la pérdida de homogeneidad del PRP (el PRP se «aclara»), lo que hace disminuir su densidad óptica o, dicho de otra manera, hace aumentar la cantidad de luz transmitida que llega al detector. El aumento en el tiempo de la luz transmitida a través de la cubeta se traduce en una gráfica con una forma y una pendiente determinadas

Procedimiento

Antes de proceder a efectuar las pruebas hay que tener en cuenta varias consideraciones:
– Las muestras deben enviarse al laboratorio inmediatamente después de su obtención y procesarse sin demora tras su recepción. Las pruebas deberían completarse en un plazo máximo de cuatro horas desde la extracción.
– Si el PRP se obtiene por centrifugación suave de la sangre anticoagulada (aproximadamente 200 g), una vez trasvasado a un tubo limpio de polipropileno (no activa las plaquetas) debe dejarse reposar por lo menos 30 minutos antes de realizar la prueba. De esta manera se evita el efecto refractario de las plaquetas frente a la agregación provocado por la centrifugación. Esto no es necesario si el PRP se obtiene dejando sedimentar la sangre anticoagulada.
– Se puede realizar un recuento previo de plaquetas en el PRP, ya que valores extremos, muy bajos o muy altos, pueden afectar a los resultados.
Los resultados obtenidos en PRP con recuentos < 150 . 103/ul deben ser tratados con cautela. Los  PRP con recuentos > 106/ul, se pueden diluir con PPP del propio paciente antes de realizar las pruebas.
Los pasos a seguir para la realización de cada prueba son los siguientes:

1. Encender el agregómetro para precalentar a 37 C.
2. Seleccionar la velocidad de agitación del PRP (normalmente entre 900 y 1.200 rpm).
3.Introducir en el portacubetas una cubeta desechable con la cantidad adecuada de PRP (por ejemplo 0,45 ml) y ajustar el 0% de transmisión (representa el 0% de agregación).
4. Sustituir la cubeta anterior por otra con PPP del mismo paciente (0,5 ml) y ajustar el 100% de transmisión (representa el 100% de agregación). Puede ser necesario repetir los pasos 3 y 4 varias veces hasta que no se requieran más ajustes.
5. Colocar nuevamente la cubeta con PRP y dejar precalentar a 37 C durante 2-5 minutos.
6.Agregar el volumen adecuado del agonista al fondo de la cubeta y registrar el cambio de densidad óptica durante tres minutos. Es importante que el agonista se añada directamente en el seno del PRP y no en las paredes de la cubeta, con lo cual se evita la formación de burbujas.

¡Tenlo en cuenta!

El volumen máximo de agonista que se añade a la cubeta no debe superar la proporción 1/10del volumen total en el que se realiza la prueba y el factor de dilución hay que tenerlo en cuenta para saber cuál es la concentración final de agonista a la que se realiza la prueba.

Por ejemplo:

si a un volumen de PRP de 0,45 ml, se le agregan 0,05 ml de una solución de ADP 20 uM, la concentración final de ADP a la que se realiza la prueba es 2 uM.

El procedimiento se repite para cada agonista y cada concentración

El panel básico de agonistas más utilizado, suficiente para identificar los diversos trastornos de la función plaquetaria, incluye ADP, epinefrina, colágeno, ristocetina y ácido araquidónico. En la TABLA 6.4 se detallan las concentraciones iniciales recomendadas, el rango de concentraciones que se deben testar cuando hay alteraciones y los receptores o vías implicados en cada caso.
En los estudios de agregación se suele incluir también una prueba de agregación espontánea en la que se registra cualquier cambio en la densidad óptica de un PRP sin agregar agonista durante 15 minutos.

Interpretación de los resultados

Las curvas de agregación con las concentraciones iniciales de ADP, epinefrina y ristocetina suelen ser bifásicas,con una onda primaria debida al efecto directo inducido por el agonista introducido en la cubeta y una onda secundaria debida a la generación y secreción de tromboxano y de factores de activación endógenos. (FIG. 6.15)
A concentraciones de agonista más elevadas a la inicial, la onda primaria puede ser tan intensa que encubra la secundaria.
A concentraciones de agonista menores a la inicial puede no haber onda secundaria y la primaria puede revertir con el tiempo (ADP) o no (epinefrina).
Las curvas de agregación del ácido araquidónico y del colágeno suelen ser monofásicas (una única onda de agregación), precedidas por una fase de demora. En este caso se valora, tanto la duración de la fase de demora como la intensidad de la agregación.

Además de la gráfica de agregación, el agregómetro suministra tres resultados cuantitativos:
-Porcentaje de caída de la densidad óptica a los tres minutos de la agregación del agonista.
-Pendiente inicial de la curva de agregación.
-Concentración umbral del agonista para inducir una respuesta de segunda fase.

6.5.4.CITOMETRÍA DE FLUJO

La citometría de flujo se ha revelado como una potente herramienta para suministrar información que permita afinar en el diagnóstico de enfermedades asociadas con alteraciones funcionales de las plaquetas. Los estudios se canalizan en dos sentidos:
– Cuantificación de la fracción de plaquetas inmaduras (FPI). Las plaquetas inmaduras son más grandes que las envejecidas y contienen restos de ARN que se puede teñir con colorantes fluorescentes de ácidos nucleicos. Así, el citómetro de flujo puede detectarlas e incluso cuantificar la cantidad de ARN presente en cada plaqueta según la intensidad de la fluorescencia. La FPI se calcula como el resultado de dividir el número de plaquetas inmaduras entre el número total de plaquetas. Algunos contadores hematológicos automáticos proporcionan este parámetro.
– Patrón de expresión y cuantificación de receptores y glicoproteínas de membrana mediante anticuerpos específicos marcados con fluorocromos. Permite establecer el fenotipo plaquetar, lo que supone un avance definitivo para:
      -La confirmación diagnóstica de síndromes como el de Bernard-Soulier (déficit de GP Ib) y de la trombastenia de Glanzmann (déficit o alteración de GP Ilb/Illa), identificando incluso los estados heterocigotos.
      -El análisis del estado de activación de las plaquetas, detectando la sobreexpresión de ciertos receptores y la exposición de fosfolípidos aniónicos y moléculas presentes en los gránulos, como la P-selectina.
En relación con el procedimiento operativo, hay que tener en cuenta algunas precauciones:

– El marcaje de las plaquetas con colorante fluorescente o con anticuerpo marcado con fluorocromo se puede realizar a partir de sangre total citratada o de PRP. Muchos laboratorios prefieren utilizar sangre total para evitar una posible activación o pérdida de subpoblaciones de plaquetas por la centrifugación.
– Las incubaciones con los anticuerpos marcados con fluorocromos se realizan a temperatura ambiente y en oscuridad.
– Antes de pasar la muestra marcada por el citómetro de flujo se diluye en la proporción adecuada con un tampón o un fijador suave. Estos reactivos deben filtrarse antes de su uso con un filtro de 0,2 um.
– Las mezclas de los distintos reactivos con la muestra deben hacerse por inversión suave del tubo tapado, nunca con vórtex, para evitar la agregación de las plaquetas.

6.5.5. Cuantificación de nucleótidos de adenina

La cuantificación de nucleótidos de adenina (ADP y ATP) totales presentes en un número determinado de plaquetas, junto con la medida del ADP y ATP liberados tras la activación de las plaquetas son fundamentales para detectar deficiencias en el pool de almacenamiento de las plaquetas y, en concreto, en lo referente a los gránulos densos: disminución de su número, déficit de su contenido o alteración en la degranulación.
En estas pruebas se parte de PRP y es imprescindible realizar un recuento previo de plaquetas en él, puesto que la concentración de nucleótidos medida remite a una cantidad determinada de plaquetas para poder comparar los resultados. Seguidamente se realiza un lisado de plaquetas, que provoca la liberación al medio de todos los nucleótidos presentes en el interior de los gránulos y en el citoplasma de las plaquetas.

La determinación de los nucleótidos totales se realiza sobre este lisado. Se puede realizar por HPLC o por bioluminiscencia, mediante el sistema luciferina/luciferasa. Con esta última metodología se determina directamente el ATP y la medida de ADP requiere un paso previo de conversión del ADP a ATP mediante piruvato quinasa.
Algunos agregometros funcionan también como luminómetros, lo que permite medir en tiempo real la liberación de ATP durante el ensayo de agregación plaquetaria.

6.5.6. Otras pruebas para estudiar las plaquetas

Existen pruebas, cuyo uso suele restringirse a laboratorios especializados, que permiten definir la etiología o confirmar el diagnóstico de algunas enfermedades raras relacionadas con la hemostasia primaria. Entre ellas podemos mencionar:
– Cuantificación de proteínas almacenadas en los gránulos a (factor plaquetario 4, factor de crecimiento derivado de plaquetas, ß-tromboglobulina) y en los gránulos densos (serotonina). Se puede realizar mediante ELISA, RIA o western blot y tiene utilidad en el estudio de deficiencias del pool plaquetario.
– Microscopía electrónica, para detectar alteraciones estructurales de la plaqueta (principalmente del citoequeleto y del sistema granular).
– Biología molecular, que permite el diagnóstico de enfermedades hereditarias y la detección de mutaciones adquiridas en células precursoras de la médula ósea responsables de patologías como la trombocitemia esencial. Las estrategias más empleadas incluyen la amplificación mediante PCR y la posterior secuenciación de los genes que ejercen alguna función en las patologías en estudio y la PCR a tiempo real. 

6.5.7. Estudio de la EvW

Los distintos tipos de enfermedad de von Willebrand (EvW) tienen en común una alteración en el FvW. Esa alteración puede ser:
– Cuantitativa: se refleja en un déficit mayor o menor del factor (tipos 1 y 3).
– Cualitativa (estructural): se refleja en una disfunción molecular (funcionamiento anómalo), como ocurre en todas las variedades del tipo 2.
Los pacientes con EvW presentan recuentos de plaquetas y morfologías normales y tiempos de obturación alargados, tanto con COL/ADP, como con COL/EPI. La prueba que hace sospechar de una EvW es el test de agregación plaquetaria con ristocetina. La ristocetina es un antibiótico capaz de inducir la agregación de las plaquetas mediante la uníón del FvW plasmático al receptor GP Ilb, principalmente mediante los multímeros de elevado peso molecular.
El test de agregación se realiza con dos concentraciones de ristocetina: una baja (0,5 mg/ml) y otra alta (1-1,25 mg/ml). En condiciones normales, a concentración baja no hay respuesta y a concentración alta las plaquetas se agregan.
La ausencia de agregación o una respuesta deficiente a concentraciones elevadas de ristocetina son indicativas de EvW o de síndrome de Bernard-Soulier. La distinción entre ambas consiste en repetir la prueba añadiendo una fuente de FvW: en la EvW el resultado se normaliza, mientras que en el síndrome de Bernard-Soulier (defecto del receptor) el resultado sigue siendo anormal.
Una agregación normal a concentraciones elevadas de ristocetina y una respuesta aceptable (> 30%) a concentraciones bajas es diagnóstica de una EvW tipo 2B, ya que implica un aumento de afinidad del FvW por la GP Ilb.

Sin embargo, el diagnóstico de EvW no es suficiente para instaurar un tratamiento, ya que las manifestaciones clínicas y la gravedad de cada tipo de EvW son muy variables. La mayor parte de los pacientes desarrollan formas leves de la enfermedad y solo un pequeño porcentaje padece un trastorno hemorrágico clínicamente relevante.
Es, por lo tanto, importante diagnosticar el tipo concreto de EvW, puesto que el tratamiento varía de uno a otro. Para ello se ha desarrollado una batería de pruebas específicas, encaminadas a cuantificar el FvW (FvW antigénico), detectar alteraciones funcionales (cofactor de la ristocetina, FvW actividad, capacidad de uníón al colágeno) y estudiar la composición de multímeros.
FvW antigénico
La determinación del FvW antigénico (FvW:Ag) consiste en la cuantificación del FvW plasmático mediante inmunoensayo con anticuerpos específicos. La prueba mide la concentración de la molécula, pero no contempla su funcionalidad.
La metodología más usada ha sido el ELISA cromogénico en placa de microtitulación, aunque recientemente se han desarrollado kits comerciales adaptados a coagulómetros automáticos basados en inmunoturbidimetría.
En estos kits se añade plasma a una suspensión de partículas de látex recubiertas de un anticuerpo específico anti-FvW. La uníón del FvW plasmático al anticuerpo provoca la aglutinación de las partículas de látex, disminuyendo la turbidez de la suspensión.
FvW cofactor de la ristocetina
El test FvW cofactor de la ristocetina (FvW:CR) es una prueba funcional que valora la capacidad de uníón del FvW de un paciente al receptor GP Ib/IX/V de las plaquetas.

La prueba consiste en un test de agregación en el que se utilizan plaquetas comerciales fijadas y una concentración elevada de ristocetina. La mezcla de ambos reactivos se coloca en una cubeta dentro del agregómetro. Al no haber FvW en el medio no se produce agregación.
A continuación se añade en el fondo de la cubeta PPP del paciente (única fuente de FvW en la cubeta) y se registra la curva de agregación de las plaquetas comerciales. La pendiente de dicha curva es proporcional a la cantidad de FvW funcionante presente en el PPP del paciente.

El FvW:

CR es de gran utilidad para diferenciar los tipos 1 y 3 de los tipos 2:
– En los tipos 1 y 3 el valor de FvW:CR se encuentra por debajo de los valores normales (sobre todo en el tipo 3),pero el resultado de dividir FvW:CR entre FvW:Ag es próximo a 1 (> 0,7), porque prácticamente todo el FvW es funcionante (es un defecto cuantitativo).
-En los tipos 2 (sobre todo 2A y 2M) el valor de FvW:CR es también inferior a lo normal, pero el FvW:Ag es normal (aunque no funcionante), por lo que el cociente FvW:CR/FvW:Ag es bajo (< 0,7).
FvW actividad
La prueba FvW actividad (FvW:Act) es también una prueba funcional similar a la anterior adaptada a coagulómetros automáticos basados en inmunoturbidimetría con partículas de látex. Estas partículas están recubiertas de un anticuerpo específico que reconoce el epitopo del FvW activo por el que se une al receptor glicoproteico de la plaqueta. Al añadir PPP de un paciente a una suspensión de dichas partículas se produce la aglutinación de estas y una disminución de la turbidez, proporcional a la cantidad de FvW funcional presente en el PPP. La utilidad y la interpretación de los resultados es similar a la de la prueba FvW:CR.

FvW capacidad de uníón al colágeno
La prueba FvW capacidad de uníón al colágeno (FvW:CB) estudia otro aspecto funcional del FvW: su capacidad,especialmente de los multímeros de alto peso molecular, de unirse al colágeno.
La metodología se basa en la técnica ELISA en placa de microtitulación con una pequeña modificación: los pocillos están revestidos de colágeno en lugar de anticuerpos, por lo que únicamente se va a cuantificar el FvW funcional con capacidad de uníón al colágeno. Como el resto de pruebas funcionales, permite distinguir los tipos 2 de los tipos 1 y 3.

6.5.8. Pruebas para valorar la fragilidad vascular

Las pruebas que valoran la fragilidad vascular son útiles para estudiar las púrpuras vasculares o angiopáticas:trastornos de la pared vascular que provocan hemorragias espontáneas por traumatismos ligeros en piel, mucosas y tejidos subcutáneos. Las pruebas de la hemostasia ayudan al diagnóstico en estas enfermedades, por exclusión de afectaciones primarias de las plaquetas y de los factores de la coagulación. Una prueba que valora la fragilidad capilar específicamente es la prueba de Rumpel-Leede.

Prueba de Rumpel-Leede

La prueba de Rumpel-Leede o del torniquete evalúa la resistencia de las paredes capilares ante un aumento de presión intravascular con anoxia.
Para realizarla, se coloca el manguito de un esfigmomanómetro en el brazo del paciente, por encima del pliegue del codo, se infla a una presión intermedia entre la sistólica y la diastólica y se mantiene durante 5min
Esta situación origina un aumento de la presión intracapilar y anoxia en el antebrazo, responsable de posibles extravasaciones, que se observan en forma de petequias.

El resultado de la prueba se considera positivo cuando en un área de 10 cm2 previamente marcada en el antebrazo del paciente se observan más de 30 petequias.

Tiempo de coagulación

El tiempo de coagulación es el tiempo que tarda en formarse un coágulo a partir de sangre total no anticoagulada que se pone en contacto con una superficie de vidrio. 
La prueba se realiza inmediatamente después de la extracción, introduciendo una pequeña cantidad de sangre sin anticoagulante en un tubo de vidrio limpio y midiendo con un cronómetro el tiempo que tarda en generarse un coágulo. Para que la prueba sea reproducible hay que estandarizar algunos aspectos:
· Los tubos deben ser siempre del mismo tamaño, por ejemplo de 75 x 10 mm.
· La temperatura de incubación debe ser de 37 C, por lo que se requiere un baño termostatizado.
· El volumen de sangre empleado debe ser constante, por ejemplo 1 ml.
· El cronómetro se pone en marcha una vez dispensada la sangre en el tubo. El tubo se mantiene en el baño a 37 C durante 4 minutos y a partir de ese momento se visualiza cada 30 segundos, inclínándose ligeramente para comprobar el estado líquido de la sangre. Cuando se detecta la formación del coágulo, se detiene el cronómetro.
El tiempo normal de coagulación oscila entre 5 y 10 minutos. Valores más alargados indican, de manera inespecífica, algún trastorno relacionado con la hemostasia o algún tratamiento anticoagulante.

6.5.10. Control de los tratamientos antiagregantes

Las enfermedades tromboembólicas vasculares de tipo oclusivo presentan una morbilidad y mortalidad elevadas, por lo que continuamente se investigan métodos efectivos para su prevención y tratamiento. Las alteraciones vasculares y plaquetarias son una causa etiológica importante de trombosis, especialmente arteriales, mientras que las alteraciones de la coagulación ocasionan más frecuentemente trombosis venosas.
Los fármacos disponibles en la actualidad para el tratamiento de las enfermedades tromboembólicas pueden clasificarse en tres grandes grupos:

Antiplaquetarios:

afectan a la adhesión o a la agregación de las plaquetas (antiagregantes). Pueden actuar por tres mecanismos:

-Inhibición de la ciclooxigenasa

El ácido acetilsalicílico (aspirina, adiro) es un potente inhibidor de esta enzima y es el antiagregante más utilizado. De hecho, es el patrón que se utiliza actualmente para la valoración de nuevos antiagregantes.

-Bloqueo del receptor de ADP

Se utilizan antagonistas del receptor que lo bloquean de forma irreversible,como el clopidogrel y la ticlopidina.

-Bloqueo de la glicoproteína Ilb/Illa

Se utilizan anticuerpos quiméricos (Abciximab), péptidos sintéticos y antagonistas no peptídicos.

Anticoagulantes:

impiden la formación de la fibrina.

Fibrinolíticos:

digieren la fibrina o estimulan la lisis natural de la fibrina.
Algunas de las pruebas que se han estudiado en unidades anteriores, enfocadas al estudio de alteraciones plaquetarias en relación con patologías hemorrágicas, se pueden utilizar también para detectar un exceso de función plaquetaria en relación con fenómenos tromboembólicos.

La cuantificación mediante ELISA de marcadores bioquímicos de activación plaquetaria generados in vivo, como el tromboxano A2, es especialmente útil, así como la detección mediante citometría de flujo de marcadores de superficie indicativos de activación plaquetar, como formas activas de integrinas de membrana o exposición de proteínas de los gránulos plaquetarios.
Finalmente, la agregometría se puede utilizar también para controlar los tratamientos con medicamentos antiagregantes y también para investigar la falta de respuesta de algunos pacientes al tratamiento.

AGREGOMETRÍA

Este estudio mide en tiempo real la agregación de las plaquetas en una muestra de PRP mediante aclaramiento óptico. Esta prueba requiere un agregómetro (espectrofotómetro) en el que se deposita la muestra de PRP en un recipiente o cubeta de incubación a 37°C, que se encuentra entre una fuente de luz y una fotocelda de medición que calcula la densidad óptica o turbidez del PRP. La preparación del PRP requiere la separación de los eritrocitos y leucocitos del plasma y las plaquetas en una muestra de sangre completa, mediante centrifugación lenta (1000 rpm) durante 15 minutos.
También se requiere la preparación de una muestra de plasma pobre en plaquetas (PPP), que se obtiene por centrifugación rápida (3000 rpm). La calibración de la trasmisión de la luz a través del PPP (plasma claro) se ajusta al 100%; la transmisión de luz a través del PRP (plasma turbio u opaco) entonces se ajusta a 0%.  

Después, se agrega una de varias sustancias conocidas por su efecto agonista sobre las plaquetas, con la finalidad de inducir agregación de las plaquetas y simular in vitro lo que sucede in vivo. En un estudio de rutina se incluyen: epinefrina, ADP, colágena, ácido araquidónico, trombina y ristocetina (un antibiótico que estimula la agregación por aumento de la uníón de FvW a la GP Ib) Mientras se realiza este proceso, la luz pasa a través de la cubeta con el PRP y se captura por el detector o fotocelda en el lado opuesto.
Conforme las plaquetas se agregan en respuesta al agonista, el PRP se aclara y se transmite mayor cantidad de luz. La transmisión de la luz se mide en tiempo real y se realiza una gráfica del porcentaje del aclaramiento de la muestra; a mayor agregación plaquetaria, mayor transmisión de la luz y viceversa.     

Etiquetas: Enfermedad de von Willebrand, Hemostasia, Hemostasia Primaria, plaquetas, Trombocitopenia, trombocitosis, Trombopoyesis