Validación de Métodos Analíticos

Debe demostrarse que el método cumple con ciertos criterios o características de funcionalidad. Cuando esto se demuestra, se dice que el método está validado.

Terminología en Metodología Analítica

Técnica:

Es un principio científico que puede ser útil para suministrar información sobre la composición de una muestra.

Método:

Es la adaptación de una técnica para un propósito específico.

Procedimiento:

Un procedimiento consiste en la información escrita necesaria para la correcta utilización de un método.

Protocolo:

Es una serie de directrices precisas y definidas que deben seguirse para que los resultados analíticos se acepten para un propósito específico, determinando si un resultado es válido o no válido.

Etapas para el Desarrollo de un Método Analítico

• Investigación bibliográfica
• Definir las condiciones de trabajo
• Desarrollar el método
• Estandarizar el método
• Validar/Verificar/Transferir

Definición de Validar

Validar es verificar documentalmente que un método o proceso hace lo que tiene que hacer.

Validación de Métodos según ISO 17025

Los laboratorios deberán validar los métodos no estandarizados, los métodos diseñados y desarrollados en el laboratorio, y los métodos estandarizados utilizados fuera de sus intervalos previstos o por ampliación de sus aplicaciones.

Métodos Susceptibles de Ser Validados

• Ensayos de identificación
• Ensayos de determinación de analitos
• Características farmacopeicas
• Ensayo de límite de impurezas y su cuantificación
• Determinación de analitos en fluidos biológicos y productos naturales
• Ensayos microbiológicos

Clasificación de Métodos

Los métodos pueden ser:

• Método normalizado (farmacopeico y compendiado)
• Método normalizado-modificado
• Método no normalizado

Fases de una Validación

• Fase de desarrollo
• Validación
• Aplicación

Documentación de Validación

• Protocolo de validación
• Realización de la validación
• Evaluación de los resultados analíticos
• Informe de validación
• Certificado de validación

Tipos de Validación

Prospectiva:

Proceso de validación para metodologías nuevas.

Retrospectiva:

Para métodos utilizados a diario no validados anteriormente y de los cuales se dispone de suficiente documentación para probar la bondad del método.

Cuándo y Qué se Debe Validar

Instrumental:

Antes de su uso de rutina.

Sistema de Cómputo:

Durante y al final del proceso de desarrollo, durante el proceso de instalación, antes y durante el uso de rutina, y después de actualizaciones.

Método Analítico:

Antes del uso de rutina y después de algún cambio en los parámetros del método.

Sistema Analítico:

Deben verificarse los parámetros de aceptación antes y durante el proceso de rutina.

Parámetros de Validación

1. Selectividad

Capacidad de un método analítico para medir e identificar simultánea o separadamente los analitos de interés, en presencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la muestra.

Por adición de las interferencias:

Técnicas confirmatorias para productos de degradación:

• Ensayos de degradación
• Hidrólisis (reflujo H₂O 1 hr, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina)

Selectividad del método analítico:

Pruebas de identificación:

Se debe demostrar que el método funciona en presencia de otras sustancias que puedan interferir y de otros compuestos relacionados.

Pruebas de pureza:

Se debe demostrar que el método analítico permite evaluar las impurezas que se pretenden analizar cualitativa o cuantitativamente.

En pruebas de cuantificación:

Cuando se determina la pureza de una materia prima o el contenido de un principio activo u otro componente en un medicamento, se debe asegurar que la señal observada procede únicamente del analito sin ninguna interferencia de excipientes, productos de degradación e impurezas.

2. Linealidad y Rango

Linealidad:

Es la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango establecido.

Rango:

Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior del analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad.

3. Precisión

Expresa el grado de concordancia entre una serie de medidas tomadas múltiples veces a partir de una misma muestra homogénea en condiciones prescritas. Se expresa como el CV (coeficiente de variación).

• a) Repetibilidad: Medida de la precisión del método cuando este se realiza por el mismo analista, el mismo día, con los mismos reactivos y el mismo instrumento.
• b) Precisión Intermedia: Determina la precisión dentro de un laboratorio cuando el método se efectúa con diferentes analistas, con diferentes equipos o en diferentes días.
• c) Reproducibilidad: Mide el grado de concordancia entre resultados de ensayo individuales obtenidos sobre la misma muestra con el mismo método, pero en diferentes laboratorios con diferentes analistas, empleando diferentes equipos, no necesariamente en intervalos cortos de tiempo.

4. Exactitud

Concordancia entre el valor determinado y el valor verdadero.

5. Límite de Detección (LOD) y Límite de Cuantificación (LOQ)

Límite de Detección (LOD):

La mínima concentración o cantidad de analito que presenta una respuesta que es significativamente diferente de la respuesta del blanco. Y = Y_BR + 3S_DBR

Límite de Cuantificación (LOQ):

El límite de cuantificación de un analito por un procedimiento analítico individual corresponde a la más baja cantidad del analito que puede determinarse cuantitativamente con precisión y exactitud aceptables (ICH, USP).

Métodos para la determinación de LOD y LOQ:

1. Determinación de la relación señal/ruido: Se evalúa la respuesta (r) producida por el blanco de la muestra o matriz y la misma se compara con la respuesta (s) de muestras preparadas mediante la adición de pequeñas cantidades de analito al respectivo blanco.

   RUIDO x 3 = LOD = S

   RUIDO x 10 = LOQ = S

2. Estudio de la menor cantidad detectable: Se determina mediante el análisis de muestras con cantidades o concentraciones conocidas de analito y estableciendo el nivel mínimo en el que este puede detectarse con confianza.
3. A partir del valor de la ordenada al origen: Empleando el valor del intercepto (a) hallado en el ensayo de linealidad. El límite inferior de la respuesta se toma como 3a y el límite de detección como 3a/b (AEFI).
4. Análisis repetido del blanco de la muestra: Determinando la magnitud de la respuesta de fondo analizando un cierto número de blancos de la muestra y calculando luego la desviación típica de la respuesta (S).

6. Robustez

La robustez de un método analítico es la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequeñas variaciones de ciertos parámetros.

7. Sensibilidad

Capacidad de un método de análisis para discriminar pequeñas diferencias en concentración o masa del analito.

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