09 Jul
Introducción a las Reacciones de Inmunoprecipitación
Las reacciones de inmunoprecipitación se producen cuando un antígeno soluble interactúa con un anticuerpo específico, formando unos complejos antígeno-anticuerpo que se organizan entre sí, dando lugar a una especie de enrejado insoluble. Para que este tipo de reacciones se produzcan, tanto el antígeno como el anticuerpo deben ser multivalentes.
Tipos de Reacciones de Inmunoprecipitación
Las reacciones de inmunoprecipitación pueden clasificarse según el medio en el que se realizan:
Reacciones en Medio Líquido (Floculación)
Las reacciones realizadas en medio líquido producen un precipitado con unos componentes unidos laxamente, que reciben el nombre de reacción de floculación.
Reacciones en Gel (Inmunodifusión)
Las reacciones de precipitación en gel, o inmunodifusión, son las reacciones de inmunoprecipitación que se llevan a cabo en un medio semisólido. Este medio suele ser gel de agar o de agarosa.
Influencia de las Concentraciones Relativas del Antígeno y del Anticuerpo
Las concentraciones del antígeno y del anticuerpo deben ser equivalentes. En esta situación, en la que el antígeno y el anticuerpo están en proporciones equivalentes, se llama punto de equivalencia. Cuando hay un exceso de anticuerpos, se produce el fenómeno de prozona, y cuando hay un exceso de antígeno, se produce el fenómeno de postzona.
Reacciones en Medio Semisólido: Principios y Técnicas
Estas técnicas consisten en el desplazamiento de antígenos y/o anticuerpos a través de un medio, donde producen una banda de precipitación cuando ambos están en concentraciones adecuadas.
Doble Difusión (Ouchterlony)
La inmunodifusión doble en dos dimensiones fue descrita por Ouchterlony y tiene los siguientes pasos:
- Verter el gel en una placa de Petri.
- Taladrar unos pocillos: uno central y varios periféricos.
- En el pocillo central se coloca el anticuerpo y en los periféricos el antígeno.
- Ambos reactivos difunden en el gel de forma radial hasta alcanzar su punto de equivalencia y precipitar.
Patrones de Precipitación en Doble Difusión
En la inmunodifusión doble bidimensional se pueden observar tres patrones de precipitación diferentes:
Patrón de Identidad Total
Las dos líneas de precipitación adyacentes se prolongan entre sí, dando lugar a una única línea continua.
Patrón de Identidad Parcial
Las dos líneas adyacentes presentan una especie de espolón en la zona de intersección. El espolón siempre apunta hacia la muestra que contiene el antígeno más específico con respecto al anticuerpo entre ambos.
Patrón de No Identidad (o Desigualdad)
Las dos líneas adyacentes muestran dos espolones a nivel de su zona de confluencia, y ambas se cruzan. Esto quiere decir que los antígenos no tienen ningún determinante antigénico común.
Para cuantificar los diferentes tipos de antígenos, se realizan diluciones seriadas de la muestra. Se sitúa cada dilución preparada en un pocillo distinto de la periferia de la placa. Cuando se realiza la difusión en la placa, se comparan los resultados obtenidos con la muestra con los conseguidos en otra placa con un patrón de antígeno de concentración conocida.
Inmunodifusión Radial (IDR)
La inmunodifusión radial (IDR) consiste en la reacción de inmunoprecipitación verificada en el interior de un medio semisólido entre un antígeno y un anticuerpo, obteniendo como resultado final un anillo de precipitación. A la hora de realizar la prueba, se introduce el antígeno en el interior de unos pocillos previamente taladrados en el gel que contiene el anticuerpo.
Mecanismo de la IDR
La reacción de inmunoprecipitación en la IDR es un fenómeno progresivo. Es decir, cuando comienza la difusión del antígeno, la precipitación se produce en una zona cercana al pocillo. Cuanto mayor es la concentración del antígeno en la muestra, más tiene este que difundir para poder reaccionar completamente con el anticuerpo en proporción equivalente y, por tanto, mayor es el área del anillo formado.
Factores que Influyen en el Diámetro del Anillo
Los factores que influyen en el diámetro final del anillo formado son:
- Volumen de la muestra
- Concentración del anticuerpo en el medio
- pH del medio
- Tiempo de incubación
Tiempo de Difusión del Antígeno
El tiempo necesario para la difusión total del antígeno depende de la concentración en la muestra aplicada.
Inmunoelectroforesis (IEF)
La inmunoelectroforesis (IEF) es una técnica que se realiza cuando la mezcla antigénica es demasiado compleja y los antígenos han de separarse antes de ser visualizados mediante precipitación. Una vez finalizada la migración de los antígenos, se vierte el anticuerpo en un surco o canal previamente conformado a lo largo del medio. Tras esto, se deja en reposo todo ello para que el anticuerpo y los antígenos difundan a través del medio. Aparecen unas bandas de precipitación con forma de arco en las zonas en las que el anticuerpo y los antígenos han reaccionado en concentraciones equivalentes.
Tipo de Anticuerpo Utilizado en IEF
El anticuerpo utilizado consiste en un antisuero que puede ser polivalente (se dirige contra varias inmunoglobulinas) o monoespecífico (si se dirige contra alguna inmunoglobulina o algún tipo de cadena).
Contrainmunoelectroforesis (CIE)
Esta técnica consiste en una doble difusión forzada por la aplicación de corriente eléctrica, lo que permite acortar el tiempo y aumentar considerablemente la sensibilidad de la técnica.
Condiciones de Realización de la CIE
Se realiza en gel de agar, eligiendo el pH de forma que los anticuerpos tengan carga positiva o neutra y el antígeno carga negativa.
Electroinmunodifusión
En esta técnica se realiza una difusión radial forzada por la aplicación de una corriente eléctrica.
Reacciones en Medio Líquido: Cuantificación
En estas reacciones, los complejos antígeno-anticuerpo quedan en suspensión en la muestra, dando un aspecto turbio al líquido. Estos agregados pueden precipitar con mayor o menor rapidez, produciendo copos de diferentes tamaños.
Turbidimetría
Se mide la cantidad de luz absorbida (la cantidad de luz que no es transmitida por la suspensión y no es capaz de emerger de esta en la misma dirección que el rayo incidente).
Nefelometría
Se mide la cantidad de luz dispersada por las partículas en suspensión; es decir, se cuantifica la cantidad de luz que es desviada por estas con un determinado ángulo con respecto a la dirección incidente.
Tipos de Determinaciones (en Medio Líquido)
Determinación a Punto Final
Tras procesar la muestra, se deja transcurrir el tiempo suficiente para que se formen todos los agregados. A continuación, se mide la cantidad de luz bloqueada o dispersada por la muestra y se resta de la lectura obtenida con un blanco preparado solamente a base de reactivos.
Determinación Cinética
En la determinación cinética, lo que se calcula es la velocidad con la que se forman los agregados. Esta velocidad está directamente relacionada con la cantidad de antígeno presente en la muestra.
Factores Adicionales que Influyen en la Inmunoprecipitación
Otros factores importantes que influyen en la reacción de inmunoprecipitación son:
- Temperatura
- pH
- Concentración de sales del medio
- Carga de los inmunocomplejos
- Afinidad y avidez del anticuerpo
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