Diferencias en la Transcripción entre Células Eucariotas y Procariotas

• En eucariotas, la transcripción se realiza en el núcleo y la traducción en el citoplasma. En los procariotas, transcripción y traducción se realizan a la vez.
• En procariotas hay una sola ARN polimerasa. En eucariotas hay tres:
  • ARN polimerasa I: formación del ARNr (ARN ribosómico).
  • ARN polimerasa II: síntesis de ARNhn (ARN heterogéneo nuclear), precursor del ARNm.
  • ARN polimerasa III: transcribe precursores de ARNt (ARN de transferencia) y otros ARN pequeños.
• Las ARN polimerasas de los eucariotas carecen de actividad exonucleasa 3′-5′ (función correctora de pruebas).
• Durante la elongación en los eucariotas, se añade en el extremo 5′ una capucha formada por 7-metilguanosina trifosfato.

Terminación de la Transcripción: Eucariotas vs. Procariotas

• En procariotas, la señal de terminación es una secuencia de bases palindrómica.
• En eucariotas, la ARN polimerasa transcribe regiones de ADN largas que exceden la longitud de la secuencia que codifica la proteína.
• Después de la separación del ARN, una enzima añade en el extremo 3′ una secuencia final llamada cola de poli-A.

Regulación de la Expresión Génica en Procariotas: El Operón

Un operón es un grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por elementos de control y por genes reguladores. Se compone de:

• Genes estructurales: codifican la síntesis de proteínas implicadas en un mismo proceso metabólico.
• Promotor: secuencia de ADN donde se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.
• Operador: secuencia de nucleótidos situada entre el promotor y los genes estructurales, donde se une la proteína represora.
• Gen regulador: situado en cualquier lugar del cromosoma bacteriano, y codifica la proteína que actúa como represor.
• Proteína reguladora: codificada por el gen regulador, puede ser un represor o un activador.
• Inductor: molécula que induce la expresión de los genes del operón.

Regulación de la Expresión Génica en Eucariotas

Se conoce peor debido a su complejidad y se divide en:

• Regulación pretranscripcional: requiere que la ARN polimerasa y los factores de transcripción puedan acceder a las bases nitrogenadas de las hebras de ADN. Otra manera puede ser a través de mecanismos epigenéticos.
• Regulación transcripcional: para que la transcripción se realice, es necesario que la ARN polimerasa se una al promotor del gen que regula, utilizando factores de transcripción específicos.
• Regulación postranscripcional: se procesa el ARN (splicing, adición de capuchas y colas), acto seguido se transporta al citoplasma donde se degrada el ARNm. Finalmente, la proteína formada puede ser modificada o degradada.

El Proceso de Traducción (Síntesis de Proteínas)

Consiste en la síntesis de proteínas mediante la unión de aminoácidos siguiendo el orden establecido por la secuencia de nucleótidos del ARNm. Se da en los ribosomas en tres sitios diferentes: el sitio P (peptidil), sitio A (aminoacil) y sitio E (salida).

Activación de los Aminoácidos

Los aminoácidos se encuentran en el citoplasma celular y son transportados por los ARNt que constan de dos partes importantes:

• El anticodón: tres bases nitrogenadas complementarias con las de uno de los codones del ARNm.
• El extremo 3′: lugar al que se une un aminoácido que corresponde al codón que reconoce ese ARNt.

Este proceso necesita un aminoácido, la enzima aminoacil-ARNt sintetasa y energía del ATP.

Síntesis de Proteínas

1. Iniciación:

   1. Comienza cuando la subunidad pequeña del ribosoma y el ARNm se unen en el codón iniciador (generalmente AUG), que marca el comienzo de la proteína.
   2. A continuación, entra en el sitio P del ribosoma un primer aminoacil-ARNt que lleva unido el aminoácido fMet (en procariotas) o Met (en eucariotas).
   3. A la subunidad pequeña del ribosoma, al ARNm y al primer aminoacil-ARNt se le une la subunidad grande del ribosoma, completando así el complejo de iniciación.

2. Elongación:

   1. Se inicia cuando un segundo aminoacil-ARNt entra en el ribosoma y ocupa el sitio A.
   2. Se forma un enlace peptídico entre el aminoácido que se encuentra en el sitio P y el aminoácido que ocupa el sitio A.
   3. El primer ARNt del sitio P se libera, y el segundo ARNt queda unido por un extremo que ahora lleva un dipéptido formado.
   4. Traslocación del ribosoma: el ribosoma se mueve un codón a lo largo del ARNm, desplazando el ARNt con el dipéptido al sitio P y dejando el sitio A libre para el siguiente aminoacil-ARNt.

3. Terminación de la Cadena Proteica:

   Comprende los pasos necesarios para liberar la cadena polipeptídica y separar el ribosoma del ARNm.

   1. La síntesis de la cadena polipeptídica se detiene cuando aparece en el sitio A uno de los tres codones de terminación del ARNm (UAA, UAG, UGA), que es reconocido por unos factores de liberación, liberando así el polipéptido del ribosoma.
   2. Una vez completa la traducción, la cadena polipeptídica formada, el ARNm y los ARNt abandonan el ribosoma, y las subunidades ribosómicas se disocian.

Genotecas (Librerías Genómicas)

Colección de clones que contiene todos los fragmentos de ADN obtenidos por escisión del genoma completo de una especie, de un solo gen o de una porción de un gen. Existen dos tipos principales:

• Genómicas: incluyen las regiones codificantes y no codificantes del genoma.
• De ADNc: varían según el tejido empleado, ya que representan solo los genes que se están expresando en ese tejido (ARNm).

Sondas de ADN

Son pequeños oligonucleótidos de cadena sencilla, formados por unos 20 nucleótidos, que se hibridarán con cualquier ADN recombinante que tenga secuencias de bases complementarias.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Se emplea cuando la muestra de ADN es muy escasa. Es un tipo de clonación acelular que permite amplificar una muestra muy pequeña de ADN. Los materiales necesarios son: una muestra de ADN, una secuencia de nucleótidos (cebadores), una fuente de calor, ADN polimerasa termoestable (como la Taq polimerasa) y una cantidad adecuada de desoxirribonucleótidos (dNTPs).

Tres etapas:

• Desnaturalización: se calientan los productos reaccionantes (ADN), desnaturalizando así el ADN de doble cadena en dos hebras sencillas.
• Hibridación (o Anillamiento): se enfría la mezcla de reacción para posibilitar que los cebadores se unan mediante enlaces de hidrógeno a cada uno de los extremos de las hebras de ADN molde.
• Extensión: se forman las nuevas hebras de ADN gracias a la acción de la Taq polimerasa, que sintetiza ADN a partir de los cebadores.

Aplicaciones de la PCR

• Analizar ADN de células de los embriones o el ADN de genes virales.
• Diagnóstico de enfermedades genéticas e infecciosas.
• Identificación forense.
• Estudios de filogenia y evolución.

Secuenciación de ADN: Método Didesoxi de Sanger

El método Sanger recibe el nombre didesoxi porque requiere la utilización de didesoxirribonucleótidos (ddNTPs). Precisa múltiples copias idénticas de la cadena de ADN a secuenciar, cebadores, una ADN polimerasa, los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) y cuatro didesoxirribonucleótidos (ddNTPs), cada uno marcado con un fluorocromo diferente.

1. Se desnaturaliza el ADN a secuenciar para obtener hebras sencillas.
2. Se mezclan todos los componentes de la reacción en cuatro tubos (o en un solo tubo con marcadores fluorescentes), y se forman nuevas cadenas de ADN que emplean como molde el ADN que se quiere secuenciar. La incorporación aleatoria de un ddNTP detiene la síntesis de la cadena.
3. Se separan las cadenas marcadas por tamaño cuando la mezcla atraviesa un gel de poliacrilamida en un tubo capilar, de tal manera que las más cortas son las que se mueven con mayor rapidez.
4. Se obtiene un espectrograma que, de abajo hacia arriba (de menor a mayor tamaño), nos dará la secuencia de bases del ADN.

Ingeniería Genética y Medicina

Obtención de Medicamentos

• La insulina humana producida por E. coli mediante la técnica del ADN recombinante.
• La hormona del crecimiento modificada genéticamente.
• Obtención de vacunas recombinantes.

Medicina Forense

• Identifica restos humanos y pruebas de paternidad mediante perfiles genéticos.

Clonación Terapéutica (No Reproductiva)

Creación de órganos, tejidos o células con la finalidad de curar enfermedades específicas, gracias a las células madre.

Proceso:

1. Se extrae el núcleo de una célula somática del paciente.
2. Se introduce en un ovocito enucleado (sin núcleo) de una donante.
3. El embrión se desarrolla in vitro hasta ser un blastocisto.
4. Del blastocisto se extraen células madre embrionarias y se cultivan in vitro.
5. Una vez alcanzado el número de células deseado, se disponen en los medios adecuados para su diferenciación en el tipo celular o tejido requerido.

Terapia Génica

Proceso mediante el cual se inserta material genético en células afectadas con el fin de reemplazar genes defectuosos y corregir el daño que han causado al organismo, o dotar a las células de una nueva función que cubra las deficiencias de un tejido determinado. Se utilizan vectores que pueden ser de origen viral (transducción) o no viral (transfección). Se puede llevar a cabo en células somáticas y en células germinales.

En células somáticas se puede realizar de varias formas:

• Ex vivo: se extraen células del paciente, se corrige el defecto genético en el laboratorio y luego se reintroducen en el paciente.
• In vivo: la transferencia de los genes terapéuticos se hace directamente al paciente mediante un vector.
• In situ: se lleva a cabo directamente en las células del paciente, introduciendo los genes en el órgano afectado.

Ingeniería Genética en Plantas Transgénicas

Se hace para mejorar el rendimiento de los cultivos. La técnica de ADN recombinante ha permitido conseguir plantas transgénicas resistentes a herbicidas, con mejores productos (mayor valor nutricional, resistencia a plagas) o plantas utilizadas en la industria farmacéutica.

Obtención de Plantas Transgénicas

El vector de clonación más utilizado es el plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Este plásmido lleva un segmento llamado T-ADN, que es el que se integra en el genoma de las células huésped. Se forman los plásmidos recombinantes, algunos de los cuales llevan el gen de interés, y se introducen en células vegetales.

Ingeniería Genética y Medio Ambiente

Se realiza mediante dos procesos fundamentales:

• Biorremediación: existen bacterias que de forma natural son capaces de degradar materia orgánica. Mediante ingeniería genética, se pueden modificar para que puedan hacerlo con mejor rendimiento o degradar nuevos contaminantes.
• Bioadsorción: algunas bacterias genéticamente modificadas son capaces de adsorber ciertos metales pesados que contaminan el suelo o el agua.

Obtención de Medicamentos con Animales Transgénicos

1. Se obtienen óvulos de una hembra y se fertilizan in vitro.
2. Se clona el gen de interés foráneo y se inyecta el ADN clonado directamente en el núcleo de los óvulos fertilizados. Algunos de estos óvulos integran el transgén en su genoma y lo expresan.
3. Se implantan embriones manipulados genéticamente en el útero de la madre sustituta.
4. Se consigue leche de los descendientes que contiene la proteína de interés.
5. Se fraccionan y se purifican las proteínas obtenidas.

Clonación Terapéutica vs. Reproductiva

La clonación terapéutica consiste en la creación de embriones por clonación, para emplearlos como materia prima en terapias (obtención de células madre), mientras que la clonación reproductiva persigue conseguir animales genéticamente iguales a otro a partir de una célula adulta. La transferencia nuclear es el método más utilizado en ambos casos.

Clonación por Transferencia Nuclear Somática (SCNT)

1. Se obtiene una célula somática del individuo que se quiere clonar.
2. Se extrae un óvulo de una hembra donante y se elimina su núcleo (ovocito enucleado).
3. Se reemplaza este núcleo por el de la célula somática.
4. Se desarrolla la «célula creada» (reconstruida) hasta formar un embrión (blastocisto) in vitro.
5. Se implanta el embrión en el útero de una hembra de la misma especie (madre sustituta).
6. El embrión culmina su desarrollo.
7. La descendencia es genéticamente igual al donante de la célula somática.

Características Clave del Genoma Humano

• El ser humano posee de 20.000 a 25.000 genes codificadores de proteínas.
• Más del 40% de los genes no tiene función conocida.
• Los seres humanos son idénticos en un 99,9% de su secuencia de ADN.
• La mayor parte de las diferencias se encuentran localizadas en los polimorfismos de un único nucleótido (SNP).
• Al ADN no codificante se le denominó ADN basura, ya que se creía que no tenía función alguna, pero ahora se sabe que cumple funciones reguladoras importantes.

Etiquetas: Biología Molecular, expresión génica, ingeniería genética, procariotas, traducción, transcripción