Procedimiento de Enfoque con el Objetivo de Inmersión

Para una observación óptima con el objetivo de inmersión, siga los siguientes pasos:

1. Baje completamente la platina con el mando de enfoque grueso.
2. Accione el regulador eléctrico para obtener la máxima intensidad luminosa de la fuente de luz.
3. Suba el condensador (si es posible) para visualizar claramente el círculo de luz que indica la zona de observación.
4. Abra completamente el diafragma.
5. Gire el revólver, dejándolo a medio camino entre el objetivo de inmersión y el de 40x.
6. Coloque el portaobjetos con la preparación en la platina, sujetándolo con las pinzas y situando la preparación sobre el círculo de luz.
7. Coloque una sola gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
8. Termine de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. Debe sentirse el ‘clic’ característico.
9. Mire directamente al objetivo y suba la platina lentamente hasta que la lente toque la gota de aceite y quede inmersa en ella. En este momento, se notará cómo la gota asciende y se adosa a la lente.
10. Con los ojos situados en los oculares, proceda cuidadosamente a enfocar con el tornillo micrométrico (o mando de enfoque fino). La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es de aproximadamente una décima de milímetro, por lo que se debe bajar muy poco a poco hasta observar la preparación con claridad.
11. Una vez finalizada la observación de la preparación, baje la platina y coloque el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento, ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
12. Se debe limpiar el objetivo de inmersión con cuidado, empleando un papel especial para óptica y, si fuese necesario, con un disolvente, utilizando muy poca cantidad de este. Es importante tener en cuenta que, una vez que se haya aplicado aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede usar el objetivo de 40X sobre esta zona, ya que se mancharía de aceite.

Preparación de Muestras Fijadas y Teñidas para Microscopía

A continuación, se detallan los pasos esenciales para la preparación de una muestra fijada y teñida:

1. Obtención del Frotis Bacteriano

   La muestra bacteriana se fija al portaobjetos en tres pasos:

   1. Extensión de la Muestra

      Se realiza una extensión de la muestra, también conocida como frote, frotis o película. Debe ser suficientemente delgada y lo más homogénea posible. Para obtenerla, si se tiene un cultivo bacteriano en un medio sólido (agar) y se desea teñir las bacterias de una colonia específica, se procede de la siguiente manera:

      • Ponga una gota muy pequeña de suero salino o de agua destilada en un portaobjetos.
      • Tome con el asa una porción muy pequeña de la colonia, emulsiónela en la gota de líquido y extiéndala de modo que ocupe 1 o 2 cm².

   2. Secado de la Extensión

      Se deja secar al aire o agitándola a unos 20-35 cm por encima de la llama del mechero Bunsen, de modo que el aire caliente ascendente tenga una temperatura que el operador pueda soportar. No debe calentarse más porque podría estropearse la muestra.

   3. Fijación de la Extensión

      Se pasa el portaobjetos por la llama del mechero Bunsen dos o tres veces rápidamente. Para verificar que no se ha calentado en exceso, golpee el portaobjetos sobre el dorso de la mano y compruebe que no quema. Este tratamiento coagula las proteínas bacterianas y fija las células al vidrio, lo que reduce la probabilidad de que las bacterias sean arrastradas por los líquidos que se agregan para teñir, siendo este el principal motivo que hace necesaria la fijación. Debe tenerse en cuenta que en la extensión fijada aún pueden quedar gérmenes viables, por lo que debe tratarse como material infeccioso.

2. Tinción

   Más adelante se describen los procedimientos concretos para cada tipo de tinción. Durante la tinción, los microorganismos captan el colorante. La tinción implica una reacción de intercambio de iones de colorante con los lugares activos de la superficie o el interior de las estructuras celulares. Esto permitirá contrastar mucho más el microorganismo con respecto al medio que lo rodea.

3. Lavado

   Permite eliminar el exceso de colorante. Una vez teñida la extensión, se lava con agua (dejando resbalar un chorro suave aplicado a un extremo del portaobjetos para evitar que arrastre la extensión teñida).

4. Secado

   Permite eliminar el exceso de agua que dificultaría una observación microscópica adecuada.

   • Para secar la extensión, el portaobjetos puede escurrirse colocándolo de canto sobre papel de filtro. Después, se deja secar sobre la mesa o bien se seca rápidamente sobre la columna de aire tibio que despide un mechero Bunsen.
   • Otra posibilidad consiste en absorber con un papel absorbente (normalmente papel de filtro) la mayor parte del agua, colocando el papel sobre la extensión y presionando ligeramente. Después, se termina de secar con el aire caliente del mechero Bunsen. Sin embargo, hay que ser muy cuidadoso con este procedimiento, pues es fácil que la extensión quede adherida al papel absorbente.

Optimización de la Visión: Uso de Diafragma y Condensador

Debajo de la platina y por encima de la fuente de luz se encuentran el diafragma y el condensador.

• El condensador es una lente que concentra el haz de luz, haciéndolo converger en la zona centrada del portaobjetos. De este modo, aumenta la intensidad de la iluminación, lo cual es necesario cuando se trabaja a gran aumento. El condensador se manipula con una pequeña palanca cuya forma y posición pueden variar de un fabricante a otro.
• El diafragma es una membrana de apertura variable, similar a los diafragmas de las cámaras fotográficas. Se utiliza principalmente para observaciones en fresco (sin colorantes). Dado que la mayoría de los microorganismos tienen índices de refracción similares a los del medio acuoso en el que están suspendidos, resultan difícilmente visibles a menos que ellos o la técnica sufran alguna modificación. La disminución de la apertura del diafragma puede permitir la visualización de diversos protozoos, hongos y otras entidades microscópicas. Esto se debe a que la luz incidirá sobre los bordes del objeto, formando un ángulo más agudo y aumentando así el contraste.

Hemos mencionado que el diafragma controla el contraste y el condensador controla la intensidad de la iluminación. Esto es cierto para la mayoría de los microscopios, pero es importante tener en cuenta que en algunos de estos instrumentos, debido a sus características constructivas, si se cambia la distancia entre el condensador y la preparación, también se puede modificar el contraste. En algunos microscopios, el contraste se controla incluso mejor desde el condensador que desde el diafragma.

Tipos de Microscopios

1. Microscopios Ópticos

   Producen imágenes amplificadas mediante el uso de luz visible (ondas electromagnéticas del espectro visible). Son los más usados en microbiología y se utilizan rutinariamente para identificar bacterias, hongos, parásitos y protozoos.

2. Microscopios Electrónicos

   En lugar de radiación electromagnética, utilizan un haz de electrones para obtener la imagen amplificada. Se utilizan principalmente en investigación (para el estudio de orgánulos intracelulares) y en virología.

Tipos de Microscopios Ópticos

1. Microscopio de Campo Claro

   También llamado de campo brillante o de campo luminoso. Es el de uso más común. Permiten la observación de preparaciones en su color natural o contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante.

2. Microscopio de Campo Oscuro

   Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales.

3. Microscopio de Contraste de Fase

   Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas.

4. Microscopio de Luz Ultravioleta

   Utiliza luz ultravioleta para la observación.

5. Microscopio de Fluorescencia

   La fuente de iluminación proporciona luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia de luz visible.

Es necesario puntualizar que los instrumentos de luz UV, fluorescencia o contraste de fase casi siempre tienen integrada la función de microscopía de campo claro. Asimismo, existen instrumentos que pueden desarrollar tres o las cuatro funciones citadas.

Tipos de Tinciones según las Condiciones de la Tinción

Se distinguen dos tipos principales:

• Tinción en Condiciones Normales

  Sigue la técnica general de tinción realizada a temperatura ambiente: extensión, desecación, fijación, aplicación del colorante, lavado y secado. La tinción se realiza colocando el portaobjetos con la extensión ya fijada sobre unas barras paralelas, colocadas sobre una cubeta o un cristalizador. Se añaden el colorante y otras sustancias. Los residuos se recogen sobre el cristalizador.

• Tinción en Condiciones Drásticas

  Se utiliza cuando los gérmenes no se tiñen en condiciones normales. Se recurre a la tinción con emisión de vapores. Un ejemplo es la tinción de esporas.

Tipos de Tinciones según la Complejidad de la Tinción

Podemos distinguir dos tipos:

• Tinción Simple

  Consiste en el teñido de los microorganismos mediante la aplicación de un solo colorante a una extensión fijada. Normalmente, la extensión fijada se inunda con la disolución del colorante durante un tiempo determinado, tras lo cual se arrastra con agua el exceso de colorante y el portaobjetos se seca. Por regla general, las células se tiñen uniformemente, de modo que este procedimiento es útil para determinar la morfología celular. En un número limitado de casos, también es posible observar en el interior de las células gránulos teñidos con mayor intensidad.

• Tinción Diferencial

  Se refiere a los procedimientos de tinción que ponen de manifiesto diferencias entre distintas células, o bien entre las distintas partes de una célula. Estas diferencias pueden observarse no solo por diferencias de forma, sino también de color. Habitualmente, implican el uso de más de un colorante en etapas sucesivas.

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